分子生物学检查7版.ppt

分子生物学检查 南方医院实验诊断学教研室 温淑娟 §1 基因诊断 一、基因诊断在实验诊断中的位置 二、基因诊断在临床诊断中的必要性 三、基因诊断的原理、途径 四、基因诊断在临床医学中的应用 临床医学实验诊断技术的发展 细胞形态学技术 (细胞形态和/或数量) 生化检验技术 (生物化学代谢产物和酶) 免疫学诊断技术 (识别特定蛋白质分子的差异) 分子诊断技术 (DNA/RNA和蛋白质) 基因诊断的检测对象和其在诊断中的位置 转录 翻译 分泌和表达 DNA 核膜mRNA 蛋白 细胞膜功 临床 能性产物 表现 核酸诊断 生化诊断 血清学诊断 临床诊断 （基因诊断） （酶法测定） （血清蛋白） 基因诊断的实验诊断对象 先天遗传性疾患 后天基因突变引起的疾病 外源基因侵入致病 基因诊断的常用技术 一、聚合酶链式反应 二、DNA测序 三、核酸分子杂交技术 四、单链构象多态性分析 五、单核苷酸多态性分析 六、连接酶链式反应 七、基因芯片技术 聚合酶链式反应（PCR) PCR？ PCR的原理 PCR的技术特点 反转录PCR 荧光PCR PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶链式反应 是模拟DNA体内 复制过程，在DNA聚 合酶作用下，进行 特定DNA片段的体外 复制。 PCR的技术特点 特异性强(几乎没有方法学的假阳性) 灵敏度高 简便快速 对样品要求低 PCR的局限性 RT-PCR(反转录-PCR)（reverse transcription-PCR） 模板选用的是RNA通过逆转录酶聚合而成的cDNA 模板cDNA是一条单链，在反义引物的引导下合成第二链模板DNA，此时才开始常规的PCR扩增 在RT-PCR中，模板量及所抽提的RNA极其重要 可进行一步RT-PCR或两步RT-PCR(巢式或半巢式） PCR产物电泳图 p FQ-PCR的技术特点 封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性 可定量检测，扩展了临床应用空间 光谱技术进一步提高了灵敏度—可检测单拷贝基因 荧光探针杂交，进一步提高了特异性 扩增与自动分析一体化，检测更加简便快速 PCR在临床医学中的应用 早期诊断 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证 输血源的筛选 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 核酸分子杂交技术 ?核酸分子杂交？ ?常用的核酸分子杂交技术及应用 常用的核酸分子杂交技术及应用 ? Southern印迹杂交--DNA印迹 ? Northern印迹杂交--研究RNA的方法 ? 斑点杂交--狭缝杂交。DNA、RNA均可检测 ? 原位杂交--检测DNA或RNA同时还可对其进 行细胞及基因组内定位 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism)SNP 指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 SNP在人类基因组中广泛存在。是人类可遗传的变异中最常见的一种。 基因芯片技术逐步应用于SNP检测，使大规模进行SNP检测成为可能。 SNP的意义和应用 疾病连锁分析和未知致病基因的定位 疾病的关联分析 复杂疾病或过程的基因定位 法医学应用 基因芯片Gene Chip 原理：是将大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。 基因芯片技术的应用 优生方面：避免许多遗传病的发生 疾病诊断方面： 器官移植、组织移植、细胞移植方面的基因配型 病原体诊断 §2 流式细胞术及其临床应用 流式细胞术 流式细胞仪组成及其工作原理 流式细胞术的临床应用 流式细胞技术 流式细胞技术是在流体状态下观察细胞状态的一种技术 能够对细胞或微球的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测 分类收集细胞