第六章_重组基因导入受体细胞.pptVIP

（4）显色互补筛选法 lacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补，这种互补现象称为α-互补。 具有完整乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶(Z)、IPTG和X-gal时，产生蓝色沉淀物，使菌落成为蓝色。如果在载体DNA上插入β-半乳糖苷酶基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ’)，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌落，会在含有X-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。 lac Z’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含lac Z’的重组载体转化lac Z’互补型菌株，可转译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基-β-硫代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色菌落，而lac Z’互补型菌株本身为白色菌落。当lac Z’区插入外源基因后，再转化lac Z’互补型菌株，由于不能翻译β-半乳糖苷酶，转化子即使在含有X－gal和IPTG的培养基上也只能长成白色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化子。 此方法主要用于原核生物。 以显色剂X-gal作为选择物时，DNA对照组不应出现任何菌落，感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色的，感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应有白色的，其中一项不符，就有可能挑出假的转化子菌落。 （二）利用报告基因筛选植物转化细胞 报告基因：系指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。 在植物转基因研究中，在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可以和某些目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他持殊产物的基因等。 ①新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（cat）也被用于筛选动植物转化子。 （三）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。 常用的标记基因还有： -- 胸腺核苷激酶基因（tk）、 -- 二氢叶酸还原酶基因（dhfr） -- 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基（hgprt） -- 细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(ecogpt)等。 * 参考楼士林《基因工程》p257 * 参考宋思扬《生物技术概论》（第二版）p47 * 参考楼士林《基因工程》p258 * 三亲本杂交接合转化大肠杆菌 简称为三亲本杂交转移法，是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式．适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法转化的受体菌。 非接合型质粒分子较小，缺少编码质粒转移体系所需的全部基因，不能象接合型质粒那样在宿主细胞间自我转移。但如果在宿主细胞中存在另外一种融合性的接合型质粒（即辅助质粒），非接合型质粒通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用。 接合型质粒分子较大，自我转移的随意性强，转移过程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频转移，因此难以作为基因工程载体使用。目前常用的质粒载体多是在非接合型质粒或缺失了接合转移基因的接合型质粒的基础上构建的，故重组质粒DNA分子也不能直接进行接合转化．而只能通过其迁移作用来完成。 首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。 整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，因此称为三亲本杂交接合转化法。 转化率的计算及其影响因素 转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式： 一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示； 二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。 用每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转化率之间的关系。 以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算转化率，首先必须通过菌液OD值测