侧链可还原降解的聚乙烯亚胺衍生物的合成与体外基因释放.pdfVIP

侧链可还原降解的聚乙烯亚胺衍生物的合成和体外基因释放 中文摘要 中文摘要 基因治疗就是将外源基因引入受感染的细胞内进行适当的表达，以纠正致病 基因所产生的缺陷，从而达到从根本上治疗疾病的目的。 目前实施基因治疗的主要瓶颈是缺乏安全高效的基因传递系统。尽管病毒载 体具有较高的转染效率，但存在制备复杂，有安全隐患，包装容量有限等问题。 因此，近年来人们越来越青睐于人工合成的非病毒载体。由于阳离子聚合物作为 非病毒性载体有安全性好、制备简单方便、可多次重复使用等众多优点而受到研 究者们的青睐。其中，聚乙烯亚胺(PEI)因其正电荷密度较高，且可通过“质子海 绵作用”逃离内涵体，以其结构为基础的新型阳离子聚合物载体成为研究热点。 25 kDa支化PEI是迄今为止转染效率最高的阳离子聚合物载体之一，现已经被作为 新开发的体外转染载体的比较标准，但其跟病毒性基因载体相比转染效率仍然较 低且在体内不可降解，细胞毒性较大。 本论文研究的主要目的在于对转染效果较好的基因载体25 kDa支化PEI进行改 性，引入在细胞内可还原降解的二硫键，制备出新型可降解的聚乙烯亚胺(PEI)衍 生物作为基因载体，从而实现高效低毒的非病毒基因转染。25 kDa支化PEI首先分 别与单体Ac-Cys-t t Boc及单体MAc-Cys- Boc进行迈克尔加成，然后脱保护形成取代 度分别为14、27 、34和13、19、38 的PEI-Cys衍生物，并分别命名为PEI-(Cys)x(Ac) 和PEI-(Cys)x(MAc) 。随后对这些聚合物进行了一系列的性能表征。缓冲能力测试 表明所有PEI-Cys衍生物的缓冲能力都比25 kDa支化PEI高（21.2-23.1% 比15.1%）； 凝胶电泳结果表明胱胺的修饰有利于聚合物更好的压缩DNA ，PEI-(Cys)x(Ac)在 N/P≥5/1时可以将DNA压缩为80-90 nm的小粒子，比聚合物25 kDa支化PEI压缩的复 合物粒径小（100-130 nm）。与之对比，聚合物PEI-(Cys)x(MAc)压缩DNA形成的复 合物粒子则较大（100-180 nm，N/P从30/1到5/1 ）；凝胶电泳及动态光散射（DLS ） 测试表明PEI-Cys衍生物与DNA形成的复合物在10 mM二硫苏糖醇（DTT ）的溶液 中可以快速地释放出质粒DNA ；与25 kDa支化PEI相比所有的PEI-Cys衍生物都具 有更低的细胞毒性（IC50: 100 mg/L versus ca. 11 mg/L ）；报告基因pGL3在HeLa 细胞和293T细胞中的体外基因转染实验表明，随着取代度（DS ）的提高，PEI-Cys I 中文摘要 侧链可还原降解的聚乙烯亚胺衍生物的合成和体外基因释放 衍生物的转染效率逐渐降低，而且在相似取代度的前提下聚合物PEI-(Cys)x(MAc) 比聚合物PEI-(Cys)x(Ac) 的转染效率高。在无血清和有血清条件下，聚合物 PEI-(Cys)14(Ac)及PEI-(Cys)x(MAc)与DNA在N/P 比为10条件下形成的复合物的转 染效率都明显高于25 kDa支化PEI （最高达4.1倍）。结果表明经胱胺修饰的可还原 降解的新型PEI载体有较好的发展前景，可望被成功研制为既高效又安全无毒的新 一代非病毒性基因转染试剂，应用于体内外基因转染。 关键词：基因转染；聚乙烯亚胺；复合物；质粒DNA ；生物降解；双硫键 作 者：王玉合 指导老师：钟志远 教授 II Branched Polyethylenimine Derivatives with Reductively Cleavable Periphery for Safe and Efficient In Vitro Gene Tr