CD36短发夹RNA干扰重组慢病毒抑制大鼠肺泡巨噬细胞L-TGF-β1活化及阻抑矽肺纤维化研究.pdfVIP

·中文论著摘要· CD36短发夹RNA干扰重组慢病毒抑制大鼠肺泡巨噬 细胞L．TGF．pl活化及其阻抑矽肺纤维化的研究 -▲』_-J一 刖 置 在我国，尘肺是危害工人健康最严重的一类职业病，到2006年底我国累计已 增长，其中矽肺患者占了尘肺病例的近80％。虽然我国在控制粉尘的产生和扩散、 降低作业场所粉尘浓度、改善劳动环境方面做了大量工作，而且已取得了一定的 成绩，但粉尘危害的形势依然严峻，尘肺病的预防和控制工作任重而道远。虽然 尘肺病的肺组织已有的纤维化病变难以消除，但肺纤维化是一个慢性、进行性的 病理反应过程，探索肺纤维化发病的分子机制以延缓或阻断纤维化发生发展进程 的策略，仍具有重要的实际意义。 growth 研究证明，转化生长因子-p1(Transforming 纤维化的发生发展中起最关键的作用。肺损伤后肺巨噬细胞受到刺激而被激活， 内TGF．D1的Smads家族蛋白信号传导途径；信号传入细胞核内，激活核内转录 蛋白，启动胶原蛋白的mRNA转录，合成胶原蛋白，同时抑制胶原蛋白的降解； 最终，引起肺纤维化。然而只有活化形式的TGF．Bl才能与其受体结合发挥生物 学作用。通常情况下，肺巨噬细胞被激活后，首先分泌大量潜在的非活化形式的 因此无生物学活性。但被激活的肺巨噬细胞可合成血小板反应素．1 噬细胞膜上TSP．1受体CD36特异结合而发生空间构象变化，此时邻近的纤溶酶 才能作用于该蛋白复合物产生活化的TGF．D1。 RNA干扰技术(1ⅢA 达的方法，它主要通过与目的基因mRNA相同序列的21．23nt双链小分子干扰 interference RNA(small RNA，siRNA)或发夹状RNA(shorthairpinRNA，shRNA) 来特异性高效率的抑制目的基因的表达。慢病毒载体作为一种基因转移载体目前 被广泛应用，它可感染非分裂细胞，并可将目的基因整合至靶细胞基因组而长期 表达。通过慢病毒载体介导的RNAi，使长效抑制目的基因表达成为可能。 据此，我们选择在L-TGF．131活化过程中发挥了重要作用的膜蛋白受体CD36 为靶基因，利用RNAi技术构建大鼠CD36shRNA慢病毒载体，并在体外、体内 进一步观察其阻断L-TGF．pl活化及其阻抑实验性矽肺纤维化发生发展的效果，为 研究探讨矽肺纤维化发生发展的分子机制奠定实验基础。 实验方法 一、CD36基因shRNA重组质粒的构建与鉴定 根据大鼠CD36基因的编码序列，设计4条干扰靶序列和1条对照序列，并 在两端加入酶切位点。将合成的正反向寡核苷酸链退火形成双链DNA，并连接到 素抗性筛选，挑取阳性克隆，采用PCR和DNA序列分析进行鉴定。构建的质粒 pGCL-GFP—CD36-4、pGCL-GFP-CD36-NC。 二、CI)36基因真核表达载体的构建与鉴定 将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1中，然后转化至大肠杆菌DH50t感受态菌， 经卡那霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，采用PCR、酶切和DNA序列分析进行鉴 定。构建的质粒命名为pEGFP．N1．CD36。 三、western 株293T细胞中干扰CD36表达的作用 按比例分别转染293T细胞中，转染48小时后收集各组细胞。提取总蛋白，进行 western 2 表达的靶序列。 四、重组慢病毒Lv．shCD36的包装以及滴度测定 T细胞，转染后8小时更换新鲜培养基。继 粒、pMD2G包膜蛋白质粒共转染293 续培养40小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液。采用超速离心法浓缩获得 毒培养液稀释8个梯度，然后荧光镜检GFP蛋白的表达水平来测定病毒滴度。 五、realtime-PCR和western 在大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞中干扰CD36表达的作用 时更换新鲜培养基，40小时后荧光镜检感染情况，继续培养48小时后收集细胞。 分别提取细胞中的总RNA和总蛋白，用于real 选重组慢病毒Lv．shCD36．(1、2、3、4)中有效干扰CD36表达的靶序列。 活化的阻抑作用