IL-35在急性移植物抗宿主病中的作用的研究.pdf

IL-35 在急性移植物抗宿主病中的作用研究 中文摘要 IL-35 在急性移植物抗宿主病中的作用研究 中文摘要 一、小鼠IL-35 的克隆及真核表达载体的构建 目的：构建小鼠IL-35 单链融合基因及其真核表达载体。 方法：取小鼠脾细胞，体外LPS 刺激6 小时后提取总RNA，通过RT-PCR 克隆小鼠 EBI3 和IL-12p35 cDNA；采用重叠延伸PCR ，通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3 的 DNA 序列连接小鼠EBI3 基因和IL-12p35 成熟肽基因，构建小鼠IL-35 单链融合基 因，添加 Igk 信号肽及酶切位点，并将其克隆至 pcDNA3.1 （+ ）载体。通过酶切和 测序鉴定阳性重组载体。 结果：DNA 序列分析结果表明：小鼠IL-35 单链融合基因中EBI3 、IL-12p35 和linker 的连接顺序、方向及序列完全正确。 结论：成功构建了小鼠IL-35 单链融合基因及其真核表达载体，为进一步探讨IL-35 的生物学功能奠定了基础。 关键词：小鼠白介素35 ；融合基因；重叠延伸PCR 二、IL-35 抑制急性移植物抗宿主病的作用及作用机制 目的：研究IL-35 抑制急性移植物抗宿主病的作用及作用机制。 方法：①建立 C57BL/6→BALB/c 小鼠清髓性异基因骨髓移植 aGVHD 模型。14 只 BALB/c 小鼠经预处理后随机分为 2 组：实验组水流动力学注射 IL-35 质粒 （HGT/IL-35 ）；对照组水流动力学注射空质粒（HGT/control ）；各组小鼠于 HGT 后 60 7 24 小时分别接受Co 8.5 Gy 全身照射，照射4 小时后尾静脉输注1×10 个骨髓细胞 6 +5×10 个脾细胞建立急性移植物抗宿主病模型。移植后观察aGVHD 表现，Log-rank 检验各组生存率；移植后 10d 取肺、肝脏、回肠进行病理组织学检查，移植后 10d 嵌合度检测。②应用流式细胞仪检测移植后 10d 脾、肝、肺、小肠淋巴细胞 CD3、 CD4 、CD8、CD44 、CD62L、Gr1 、CD19、NK1.1 、CD11b、CD11c 阳性细胞表达 I 中文摘要 IL-35 在急性移植物抗宿主病中的作用研究 率；胞内染色检测移植后10d 脾、肝、肺、小肠CD4+T 淋巴细胞分泌IL-10、IL-17、 TNF-α、IFN-γ 的比例及数量以及CD8+T 淋巴细胞分泌IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ 的比例及数量；流式CBA 检测移植后第10 天小鼠血清中的IL-10、IFNγ、TNFα、IL-6、 + + IL-17 水平。③流式细胞仪检测移植后 10d 脾、肝、肺、小肠 CD4 FoxP3 T 细胞、 + + + CD8 FoxP3 T 细胞的比例及数量；BrdU 掺入法检测移植后10d 脾、肝、肺、小肠CD4 、 + + + + + CD8 T 细胞的增殖以及CD4 FoxP3 T 细胞、CD8 FoxP3 T 细胞的增殖。④建立体外 混合淋巴细胞反应（MLR ）体系，以BALB/C 鼠来源的脾细胞Co6030Gy 辐照后作为