JSRV囊膜蛋白及亚基诱导NIH3T3细胞转化和分子发生机制研究.pdf

本课题由 国家自然科学基金项目 (No．3 1060332)资助 Thisworkwas fromthe supportedbygrants NationalScienceFoundationofChina 1 (No．3 060332) 摘 要 研究背景：绵羊肺腺瘤(ovine pulmonary retrovirus，JSRV)引起的一种慢性、传染性绵羊肺脏肿瘤疾病。 病毒(iaagsiektesheep 其中env是～个癌基因，它的表达产物囊膜蛋白(Env)由表面蛋白(SU)和穿膜 蛋白(TM)两个亚基组成，彼此间以二硫键相连。JSRV的受体为透明质酸酶2 3T3细胞具有强烈的接触抑制特 (Hyaluronoglucosaminidase2，Hyal．2)。由于NIH 性，能根据失去接触抑制而明确地识别己发生转化的细胞，故作为～种重要的细胞 3T3 用于JSRV致瘤机制的研究。近年的研究显示，单独表达JSRVEnv对于诱导NIH 细胞转化是必须和充分的，但其具体的转化分子机制中仍存在一些值得探讨的地方。 3T3细胞转 研宄目的：进一步探究JSRVEnv及其亚基(SU和TM)诱导NIH 化的分子机制，这对于深入阐明OPA的分子发病机制及确定相应的防控靶点，具有 重要的理论意义和潜在的应用价值。 研究方法} 3T3 建含有绵羊Hyal．2基因编码区的真核表达质粒。将该真核表达质粒转染NIH 3T3细胞系。 细胞，经G418筛选、纯化后，以制各稳定表达绵羊Hyal．2受体的N1H 2．采用JSRVEnv及其亚基真核表达质粒分别诱导转化NIH3T3细胞和稳定表 3T3细胞系，并检测比较各转染组与空白对照组间，细胞 达绵羊Hyal．2受体的NIH 的接触抑制特性、非锚定依赖性生长能力、增殪活性以及磷酸化AI(t含量的差异。 显子的突变点检测引物，采用PCR．SSCP和核酸测序分析法检测JSRVEnv及其亚 基诱导转化细胞中肿瘤相关基因的突变情况。 4．以内蒙古地区OPA自然病例的肺组织总DNA为模板，克隆JSRV前病毒的 gag、pro与pol基因，并应用双酶切的方法将其与已有的LTR、e刀v基因连接起来， 以获得含有JSRV前病毒全基因组的重组质粒。 研究结果： 3T3细胞系。 并建立了稳定表达绵羊Hyal．2受体的NIH 2．在NIH3T3细胞中，Env及TM具有诱导细胞转化、激活Akt的能力：而在 3T3细胞系中，仅TM具有这样的能力。 稳定表达绵羊Hyal．2受体的NIH 3．在JSRVEnv及其亚基诱导NIH3T3细胞转化的过程中，肿瘤相关基因kras、 Bros、P驴、p53和pik3ca均未发生突变。 4．成功构建了包含外源性JSRV前病毒基因组全长的重组质粒pMD．JSRV。核 酸序列分析结果表明，本研究重组克隆的pMD．JSRV基因组全长7690bp，具外源 系较近，同源性达95％。 结论：