乌司他丁对离体人肺血管内皮细胞保护的实验的研究.pdfVIP

摘 要 目的: 通过培养离体人肺血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cell ， PMVECs ），研究乌司他丁在不同时间点对严重脓毒症血清刺激离体PMVECs 培养基中肿瘤 坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-10 （interleukin-10 , IL-10)、细胞间粘 附分子-1 （intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1 ）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF)浓度的影响；对PMVECs 核因子-κB （Nuclear Factor kappa-B, NF-κB ） 表达的影响；对PMVECs 超微结构的影响，探讨乌司他丁治疗脓毒症致ALI ／ARDS 的机 制。 方法： 1、离体培养人肺血管内皮细胞（PMVECs ），随机平均分为正常培养组（加入 10%胎牛血 清，N 组）、健康血清组（加入10%健康人血清，H 组）、患者血清组（加入10%严重脓毒 症患者血清，S 组）。分别于0、1、2 、4 、6 小时，通过MTT 比色法测定吸光度值（optical density，OD ），比较三组PMVECs 增殖活力的变化；免疫组织化学法观察PMVECs NF-κB 的表达，测定并比较平均光密度值（average optical density，AOD ）；酶联免疫吸附法（ELISA ） 测定并比较TNF-α、IL-10 、ICAM-1、VEGF 浓度；透射显微镜下观察S 组PMVECs 亚显 微结构的改变。 2 、离体培养人肺血管内皮细胞（PMVECs ），随机平均分为正常培养组（加入 10%胎牛血 清，N 组）、健康血清组（加入10%健康人血清，H 组）、患者血清组（加入10%严重脓毒 症患者血清，S 组）、乌司他丁组（根据培养基中药物浓度不同，分为3 个亚组：U1 组：加 入100u ∕ml 乌司他丁+10%严重脓毒症患者血清；U2 组：加入500u ∕ml 乌司他丁+10%严 重脓毒症患者血清；U3 组：加入1000u ∕ml 乌司他丁+10%严重脓毒症患者血清），共6 组。 分别于0、1、2 、4 、6 小时,留取各组细胞培养基，4000 转/分，离心3 分钟后取上清液， 酶联免疫吸附法（ELISA ）测定并比较各组培养基中TNF-α、IL-10 、ICAM-1、VEGF 浓度； 于培养 1 小时，免疫组织化学法观察各组 NF-κB 表达；测定并比较各组平均光密度值 （average optical density，AOD ）；透射电镜观察6 小时各组PMVECs 超微结构的改变。 结果： 1、（1）MTT 比色法：三组不同时间点OD 值有差异（p=0.042 ），不同时间点OD 值变化趋 势有差异（p=0.005 ）。与N 组及H 组相比，S 组1h OD 值明显降低（P=0.007 ；P=0.002 ）， 随时间延长OD 值维持在较低水平。（2 ）NF-κB 免疫组化检测示：S 组PMVECs 多数胞核 呈明显阳性表达，且1h AOD 值达高峰，后逐渐下降（0.54±0.06，0.52 ±0.01，0.49 ±0.00， 0.44 ±0.03 ）；N 组及H 组PMVECs 胞核未见NF-κB 表达。（3 ）酶联免疫吸附法(ELISA)： 与N 组、H 组相比，S 组同时间点培养基中TNF-α、IL-10 、ICAM-1 、VEGF 浓度均明显升 高，且均有显著差异，S 组TNF-α均明显高于同时间点N 组，分别为：1h、2h （p ＜0.05 ）； 4h 、6h （p ＜0.01 ），S 组1h、2h 、4h 、6hIL-10、ICAM-1 、VEGF 均明显高于同时间点N 组 （p ＜0.01 ），S 组TNF-α、ICAM-1 、VEGF 含量随时间逐渐增加，IL-10 含量先增加后呈下 i 降；不同时相N 组、H 组TNF-α、IL-10 、ICAM-1 、VEGF 含量均无明显差异（P ﹥0.05 ）。 （4 ）透射电镜示：N 组与H 组电镜下胞膜完整，胞膜外见丰富的微绒毛，胞浆可见大量横 切面呈圆形或椭圆形的Wei