益肺活血颗粒对体外低氧培养大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖相关机制研究.pdfVIP

堕主鲨窒 l煳攀避 益肺活血颗粒对体外低氧培养大鼠肺动脉平 滑肌细胞增殖相关机制的研究 硕士研究生：张凌云 指导老师：欧敏 摘要 背景：低氧性肺动脉高压(HPAH)是以肺血管抵抗和肺动脉压升高为主要特征的持 续不可逆性疾病，最终导致右心衰竭甚至死亡，目前尚无特效治疗药物。近年来研究 过程中起着重要的作用。为了适应低氧微环境，细胞会启动一系列低氧相关信号通路 的转导，其中低氧诱导因子(HIF-la)是细胞缺氧时产生的一种关键核转录因子，可 调控100多种与能量代谢、细胞增殖、血管生成等相关基因的表达。另外，低氧可通 个信号途径，促进胞内Ca2+浓度的升高和各种活性介质的生成，最终导致PASMCs的 增殖和肺血管的收缩、重塑，导致肺动脉高压的不可逆性病理改变。 益肺活血颗粒(YFHXG)是著名中医内科学家董建华院士在补中益气汤与血府逐淤 汤基础之上辩证加减而配制的一组中药复方，多年来一直应用于慢性阻塞性肺疾病 (COPD)及肺动脉高压的治疗，临床疗效明显。且血府逐瘀汤具有活血化瘀功能，可 保护肺血管损伤；补中益气汤具有改善呼吸功能及血气交换作用，两组方剂都具有抗 炎及提高免疫力的功效。前期动物实验也发现该药具有保护血管内皮细胞、抑制中膜 增厚、减轻血管缩窄、降低肺动脉高压的功能，其主要机制可能是通过调节免疫和减 轻低氧所致慢性炎症反应来实现，本课题在前期研究的基础上，拟通过体外低氧培养 摘要 进一步探讨YFHXG降低HPAH的细胞分子学机制。 目的：本研究着重于观察低氧对体外培养大鼠PASMCs增殖的影响及YFHxG对这一 的调节效应，从而探讨其具体作用机制。 方法：(1)制备益肺活血颗粒：益肺活血颗粒生药的原材料由北京市卫生局临床药 物研究所鉴定审核，制作方法：把生药原材料放入重蒸水煎沸，每次3小时，合并2 次滤液，4000r／min离心15min后取上清液，浓缩，制成益肺活血颗粒，益肺活血颗 粒用生理盐水溶解配制，并直接加入到细胞培养基中，配成终浓度为7．5mg／ml、1．5 mg／ml及0．15mg／ml三种不同的浓度。 克隆抗体免疫组化染色鉴定为肺动脉平滑肌细胞，待覆盖约90％时，以胰蛋白酶消化 传代培养，采用生长良好的3-5代细胞进行实验。PASMCs随机分为常氧组(20％0。，5％ 量组(终浓度为7．5、1．5、0．15mg／m1)。 u 细胞覆盖80％后，根据分组给予YFHXG及生理盐水干预，按实验分组培养24h，48h， 10Il 72h后，每孔加入M，rT1，孵育4h后直接加入甲瓒溶解液100u1／孔。置于C02 培养箱再孵育4h，用酶标仪于570nm处测定oD值。 IIL／孔的密度接种于6孔培养板，待细胞生长基本融合后换无血清DMEM／F12同步化 培养24h，按实验分组给予低氧及YFHXG干预，各组细胞培养48h后PBS洗细胞2次， 胰蛋白酶消化，收集细胞离心去上清后加入70％的冰乙醇，置于4℃冰箱固定24h。 PBS洗3遍，加入25Il PI g／mlRNA酶500IIl，37℃水浴反应30rain，最后以50IIg／m1 溶液进行固定，上流式细胞仪测定细胞周期构成比和增殖指数 (PI=(S+G2／M)／(GO／G1+S+G2／M)×10096)。 (5)采用细胞免疫化学法测定HIF—la蛋白的表达：采用细胞免疫化学链霉素抗生 Ⅱ 硕士学位论文 的二抗，采用DAB试剂显色。 的荧光光度值来测定，按实验分组加以药物干预24h，加入DCFH-DA(终浓度为 冲洗细胞2次，以充分除去未进入胞内的DCFH—DA。将染色好的细胞置于倒置激光共 光强度反应细胞内ROS水平。 为3|I 于倒置激光共聚焦显微镜下，设定好参数(激发波长为488nm，发射波长为525nm)， 度进行统计分析。 (8)所有数据用均数±标准差(又±S)表示。用SPSSl3．0统计学软件进行分析， 组间比较用单因素方差分析(One-