耐顺铂肺腺癌细胞差异表达基因的筛选及其功能初步的研究.pdf

耐顺铂肺腺癌细胞差异表达基因的筛选及功能初步研究 摘要 研究背景 肺癌是呼吸系统常见的恶性肿瘤。由于环境污染、吸烟人数和吸 烟量的增加，近几年来，世界各国肺癌的发病率和病死率逐年上升， 在全世界范围，肺癌的发病率已高达70／10万，居恶性肿瘤的首位， 在我国许多大城市，肺癌的发病率已居恶性肿瘤第一位。美国癌症协 会的资料表明，每年癌症死亡的近50万病例中，约61％与原发性耐 药发生有关，而约33％与获得性耐药有关，绝大多数因癌症死亡的患 者直接或间接与耐药发生有关。 顺铂是肺癌及其他肿瘤化疗中使用最为广泛的药物，然而由于癌 细胞原发或继发的耐药性而疗效削弱，给临床治疗带来极大的困扰。 肺癌耐药机制是由多因素、多因子参与的复杂生物过程，任何一种机 制不可能完全解释肺癌耐药现象的发生，因此，有必要对肺癌耐药机 制进行纵深研究。 细胞的生长、分化、死亡是以特异的基因表达为基础，不同的基 因表达造成了细胞生物学行为的差异，细胞表型由它所表达的基因种 类、数量和时空顺序等因素所决定。已有肺癌的研究资料显示，不同 病理类型、不同分化程度、不同临床分期、不同转移潜能的肺癌细胞 基因表达谱存在差异。通过比较遗传背景相同，但耐药能力不同的肿 瘤细胞间的基因表达差异，有可能从中筛选肿瘤耐药相关基因。人肺 自同一亲本，具有相同的遗传背景，两者间的差异主要表现在对顺铂 的敏感和耐药性，适合于可比性研究，避免了标本取样的组织学差异， 能够全面、准确地反映所筛选的各基因间的关系。因此，选择人肺腺 料构建两者间差异表达基因谱，筛选差异表达基因，可初步确定肺腺 癌顺铂耐药相关候选基因，探讨肺癌耐药机制。 对顺铂敏感／耐药不同表型的肺腺癌细胞进行比较而筛选出的差 异基因，只能初步提供这些基因可能参与了肺癌顺铂耐药性的基本信 息，要进一步了解这些差异表达基因在肺癌顺铂耐药中所具有的作 用，则必需研究它们对肺癌耐药性表型的具体影响，即基因功能研究。 RNA干扰是近几年来生命科学中新兴起的一门技术，1998年由Fir等 发现，是一种双链RNA分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达使其 沉默的过程，为一种序列特异性转录后沉默，能产生类似基因敲除效 应。较传统方法有其特异性高、高效性、操作简单的独特优势。已成 为基因功能研究的重要手段。筛选出的肺癌耐药相关差异表达基因， 选择其中表达明显上调的基因，用RNAi技术封闭耐顺铂人肺腺癌细 胞A549／CDDP细胞中该特异基因的表达，从体外实验证实该基因参与 肺癌顺铂耐药的形成，同时，逆转其耐药性，为寻求提高肺癌铂类药 物化疗效果的有效途径打下基础。 本研究首先采用基因芯片技术，选择同一亲本的人肺腺癌细胞株 问差异表达基因谱，筛选出差异表达基因，初步确定肺腺癌顺铂耐药 相关候选基因，探讨肺癌耐药机制，也为后续研究提供线索。 通过基因芯片技术筛选获得了多个差异表达基因。通过检索既有 文献中相关基因的报道，分析这些基因在肺癌顺铂耐药中的作用，我 们选择了其中差异表达明显上调基因CDK7为目标进行后续研究。采 肺癌顺铂耐药中所具有的作用，也为确定CDK7作为靶点，逆转肿瘤 耐药研发药物提供依据。 第一章应用基因芯片筛选肺腺癌顺铂耐药差异表达基因 目的：构建人肺腺癌细胞株A549细胞和耐顺铂人肺腺癌细胞株 A549／CDDP细胞两者间差异表达基因谱，筛选差异表达基因，初步 确定肺腺癌顺铂耐药相关候选基因。方法：提取人肺腺癌细胞株A549 3．0 Array4000扫描芯片荧光信号图像，用基因图像分析软件GerePix 对扫描图像进行数字化处理和分析。结果g筛选出与肺腺癌顺铂耐药 关系相关的差异表达基因232个，有18种基因在耐药细胞中表达水 平明显上调，有50种表达明显下调，对这些基因功能进行分类，可 分为原癌基因和抑癌基因、DNA结合、转录和转录因子、细胞信号和 传递蛋白、细胞受体、蛋白翻译合成、细胞骨架和运动、代谢发育相 关基因以及未知功能基因。结论：(1)耐顺铂人肺腺癌细胞和人肺腺 癌细胞基因表达有明显差异。(2)在耐顺铂人肺腺癌细胞和人肺腺癌 H 细胞间有232个差异表达基因，这些基因按功能可分为原癌基因和抑 癌基因、DNA结合、转录和转录因子、细胞信号和传递蛋白、细胞受 体