PTEN基因在喉鳞癌中的表达及第5、第8外显子突变研究.pdf

摘 要 目 第5外显子、第8外移子的突变情况，探讨在喉鳞癌发生发展中PTEN的 作用及临床病理意义，为其防治提供依据。 方法：取自耳鼻咽喉科住院患者手术切除的新鲜喉癌组织40例，另 取正常喉粘膜做为对照9例，迅速放进液氮中速冻，深冻冰箱中保存备用。 卜游 8(11．7。计算机软件设计引物序列： 提取RNA的纯度，要求A260／A2 GAAGACCATAACCCA TTA 弓『物：5’一TTT CCA．3’，下游引物：5’．TCA CACCAGTTCGTC TGCCTCAGGACATTT cDNA，内参照为13-actin，其上游引物：5’．GAT 为690bp互补DNA(complementary 0．59L，13-actin上下游引物各0．51aL，Taq 1 ℃1 糖凝胶上电泳，溴化已锭(EB)染色，紫外灯下观察结果，将凝胶电泳图 象输入美国Kodak凝胶分析系统，应用1D ImageAnalysis 度分析。取喉鳞癌或正常喉粘膜组织约0．2克，采用苯酚．氯仿．异戊醇法 TCTTTT ATTCTGAGG’丌A 物所合成。第5外显子引物上游5’一CTT TAC AGAATCCAGGAAGAG C．3’．下游引物5’．CTC GA．3’，其扩增片 段长度为316 ACAAAATGTTTCACT bp；第8外显子}：游引物5’AGG ATA TAC ACCAAC TTT CAAGTC GGG一3’，下游引物5’．ACA CC一3’，其 扩增产物为275 个循环后，于72℃延伸7min；第8外显子反映条件如下：首次变性94℃ 95％甲酰胺，10mmol／L SSCP：取109LPCR产物，加入变性载样缓冲液f NaOH 胺凝胶电泳，电泳300V，3～4小时左右，直至溴酚蓝接近凝胶底部。DNA 看片灯下观察电泳情况，与jl三常喉组织带型一致为系统正常对照，对与此 相异的DNA带型迁移率改变即为SSCP结果阳性。PCR产物直接测序法： 统计学方法：U检验(P0．05， —www．bio-s—ofl．net／sms／index．html_软件分析。 为有显著性意义)。 mRNA扩增结果表明3-actin全部阳性， 结果：49例标本中13-actin 例阳性，且与预期片段大小相等，特异性高，但强度各不相同。正常喉粘 犁喉癌高、中、低表达率分别为45．4％，27．3％，27．3％；无淋巴结转移的 声门上型喉癌高、中、低表达率分别为57．2％，21．4％，21．4％；有淋巴结转移 的』引]上型喉癌高、中、低及无表达率分别为26．7％，33．3％，26．7％，13．3％， 声『j型及声门上型喉癌与正常喉组织相比，其mRNA表达下降，其中有 淋巴结转移的声门卜型喉癌PTEN基冈mRNA表达下降有显著性意义 增加、减少或位置的相对移动，以此确