嗜热菌糖苷酶基因LacS牛乳腺特异性表达载体构建、转染及鉴定.pdfVIP

摘 要 利用乳腺生物反应器生产生物活性蛋白，是当前生物领域研究的热点，制备乳腺 生物反应器的关键在于构建合理、表达效率高、特异性好的真核表达载体，本实验中 应用的酪蛋白是牛乳中一个主要的蛋白成分。 该研究中，以牛酪蛋白基因的上游调控成分作为启动子，嗜热菌糖苷酶基因 lacS 为目的基因，构建了一个乳腺特异性表达载体，并利用脂质体介导重构载体转染奶牛 乳腺上皮细胞和蒙古牛胎儿成纤维细胞，对转基因的奶牛乳腺上皮细胞做 DNA、RNA 及蛋白水平的鉴定。对转基因蒙古牛胎儿成纤维细胞做DNA 水平鉴定。 首先，通过 PCR 技术分别从不同模板上扩增出 CMV 启动子、poly(A)加尾序列、 lacS 基因序列、BC 启动子等部分，依次将上述序列与 pDsRed2-1 质粒相连接，利用 CMV 启动子指导红色荧光蛋白基因表达，便于筛选阳性克隆；BC 启动子指导目的基因 lacS 在奶牛乳腺进行特异性表达；从而构建乳腺特异性表达载体 pBL。 其次，利用脂质体介导重构载体转染奶牛乳腺上皮细胞，并从 DNA、RNA 及蛋白 水平进行鉴定。培养蒙古牛胎儿成纤维细胞，做形态学分析，生长曲线测定、核型分 析、性别鉴定及 G418 最小致死浓度测定。通过脂质体介导重构载体转染蒙古牛胎儿 成纤维细胞，并做 DNA 鉴定，为后续核移植实验，生产转基因动物提供体细胞。 结果表明：奶牛乳腺上皮细胞 G418 最小致死浓度为 700 μg/ml，在 DNA、RNA 及 蛋白水平上能够检测到目的基因的表达。蒙古牛胎儿成纤维细胞 G418 最小致死浓度 为 700 μg/ml。在 DNA 水平上能够检测到目的基因。综上所述，该表达载体的构建是 成功的，能够在乳腺中特异性表达，可以为核移植提供细胞来源，进行后续实验。 关键词：乳腺生物反应器；嗜热菌糖苷酶；乳腺特异表达载体；脂质体 Study on Construction and Transfection of Mammary Gland Specific Expression Vector for Ssβ-gly Abstract Producing bioactive proteins through mammary gland bioreactor is a hot focus in the field of biology, and the most important question is to construct expression vector in mammary gland. CSN is the main protein in milk. Firstly, the CMV promoter, poly(A), lacS and BC promoter were amplified from different sourses by PCR technology. Followed the above sequence are connected with pDsRed2-1 plasmid to construct mammary gland specific expression vector pBL. Using the updream regulation sequence of bovine BC regulate lacS gene for expression in mammary gland.CMV promoter regulate the expression of Red fluorescent protein gene.The poly(A) sequence is very important for expression. Secondly, use the new vectors to trasfact the bovine mammary ep