一种新的短小芽孢杆菌胶原蛋白酶的分离、纯化及酶学性质的研究.pdf

短小芽孢杆菌胶原蛋白酶的分离、纯化 及酶学性质研究 摘 要 本研究从皮革厂、畜肉市场和屠宰场等处采样，分离得到49株具有明胶水解活性的 微生物。菌株C01．C的培养液能在48h内对犊牛皮有明显消化作用，菌株C01．J则能完全消 化。经形态学观察、生理生化培养和16SrDNA序列分析，鉴定菌株C01．C为粘质沙雷氏 菌(Serratia 白为底物，菌株C01．C和菌株C01．J的胶原蛋白酶活性分别为21．19U／mL和35．97U／mL。菌 株C01．J培养液的活性凝胶电泳实验表明，该菌至少产生了3种具有胶原蛋白酶活性的同 工酶。 以短小芽孢杆菌C01．J为材料，进行胶原蛋白酶的分离纯化。发酵液离心去菌体，上 清分别采用30％饱和度和75％饱和度的硫酸铵分级沉淀，沉淀溶解后，透析脱盐、浓缩。 Fast Flow阴 将样品过SephadexG．100分子筛层析柱，收集活性峰S1。然后用过Sepharose 离子交换层析柱，收集活性峰Q3。SDS．PAGE检测表明，得到的电泳纯胶原蛋白酶，分 ％。 对纯化后的胶原蛋白酶进行酶学性质研究，结果表明：该酶的最适反应温度为45℃， 强，相对酶活达到127％；而EGTA对酶的抑制作用最为强烈，相对酶活仅为10．1％。底 物特异性实验表明，该酶对III型酸性胶原蛋白具有较高的专一性。在pH7．5，45C条件 下，该胶原蛋白酶对酸性可溶胶原蛋白III的米氏常数Km为0．79 mg／mL，最大反应速度 C01．J分离纯化的该酶是一种新的胶原蛋白酶。 关键词：短小芽孢杆菌；胶原蛋白酶；分离纯化：性质 PurificationandCharacterizationofa from Collagenase Bacillus pumilus Abstract microbeswith wereisolatedfrom and Forty—nine collagenaseactivity tannery,poultry in of and abattoir the two Col-C samplesstudy．Thesupernatantstrains，namedCol-J，could thecalfskin and onthe their digest obviouslycompletely．Basedpolyphasicstudies，including 6SrDNA and characteristics，1 analysis，Col—C phenotypic，physio—biochemicalphylogenetic Col·JwereidentifiedasSerratiamarcescenandBacillus pumilus，respectively． fromthe ofBacillus Col