系统性红斑狼疮相关分子OAS1的表达纯化、活性检测及其参和RNA干扰的初探.pdfVIP

上海交通大学医学院硕士论文 中文摘要 系统性红斑狼疮相关分子 OAS1 的表达纯化、活性检测及其参 与 RNA 干扰的初探 摘 要 背景：I 型干扰素及其诱导的信号通路和相关蛋白是SLE 新的致病 通路。2’-5’寡腺苷酸合成酶（2’-5’oligoadenylate synthetase ，OAS ）为干 扰素诱导下高表达丰度的基因之一，传统被认为是具备抗病毒特性的活 性蛋白质。既往对 SLE 患者基因表达谱的研究中发现OAS1 基因较正常人 群存在突出的高表达且与疾病活动度相关，但其在SLE疾病活动和在SLE 发病机制中究竟发挥了什么作用，目前尚不清楚。 目的：已知OAS 的活化是双链核糖核酸(dsRNA)依赖的。通常认为， 该dsRNA为各种病毒复制过程中的中间产物，OAS 的活化又进一步激活 RNasel，从而降解病毒的单链RNA。同时又有证据表明，OAS 可以抑制宿 主细胞的增殖。我们在本研究中提出假说：OAS 可能参与了机体自身的 RNA 干扰（RNA interference，RNAi），导致某些参与免疫调控、免疫耐 受基因的沉默，从而参与了 SLE 的发病。 方法：1. 在原核细胞内表达并纯化 OAS1 蛋白。pET-9d-OAS1 重组 质粒转入大肠杆菌 BL21 中，摸索适宜的诱导温度，诱导时间和诱导剂浓 度，表达 HIS-OAS1融合蛋白。利用融合蛋白的组氨酸标签、蛋白质等电 点和蛋白质分子量等理化特性，采取亲和层析，阳离子交换层析和分子 I 上海交通大学医学院硕士论文 中文摘要 筛凝胶层析技术得到高纯度的目的蛋白质，使用免疫印迹法鉴定 HIS-OAS1融合蛋白。 2. 125 I 标记的放射免疫法测定不同样本中的寡腺苷酸（2-5A）浓度， 反映不同样本中OAS 的活性水平。收集处于疾病活动期和稳定期的SLE 患者血清，活动性 RA 患者血清，HBV 感染患者血清以及正常人血清；测 定其中 125I 标记的 2-5A 水平，研究OAS1 蛋白活性水平在各组间差异性 和与SLE 疾病活动性之间的关系。同时对纯化的HIS-OAS1 融合蛋白进行 活性检测。 3.使用体外蛋白质-核酸相互作用的方法捕捉 SLE 患者体内可能与 OAS1 结合的sRNA。从SLE 活动期患者外周血中抽提RNA，与吸附在NI2+ 琼脂糖介质上的OAS1 融合蛋白反应，将捕获的目的核酸片段扩增后测序 并鉴定核酸来源。 结果：1.通过对诱导条件的摸索，成功表达HIS-OAS1 融合蛋白，经 层析技术纯化得到高纯度的 HIS-OAS1融合蛋白。 2. 经 125I标记的放射免疫法测定，SLE 患者血清中OAS 活性显著高 于正常人，活动期 RA 患者，HBV 感染患者，尤其以处于疾病活动期者为 甚，后者与稳定组之间的差异也有统计学意义。活动性 RA 组和HBV 感染 组以及正常对照组之间均无显著差异。同时检测原核表达的HIS-OAS1 融 合蛋白，提示融合蛋白具有催化生成 2-5A 的活性。 3.使用HIS-OAS1 融合蛋白捕捉到SLE 患者体内与OAS1 相互作用的 II 上海交通大学医学院硕士论文 中文摘要 sRNA，经与microRNA 库比照，提示序列与人microRNA105，人 microRNA604，人microRNA640 高度一致，可能与OAS1 存在相互作用， 该结果尚需进一步验证。 结论：本研究中，我们在原核细胞中表达并纯化了OAS1 蛋白，得到 了高纯度的融合蛋白。SLE 患者血清中OAS 活性显著高于正常人，活动 期RA 患者，HBV 感染患者，尤其以处于疾病活动期者为甚，后者与稳定 组之间的差异也有统计学意义。使用具