松果体激素的化学性质及其释放入脑脊液途径的形态学的研究.pdf

英文缩写 16 中文摘要 松果体激素的化学性质及其释放入脑脊液途径 的形态学研究 摘 要 松果体细胞带有突起，含有分泌颗粒；而且，支配松果体的神经纤维， 也可以释放神经肽；因此，松果体内肽类物质，是位于松果体细胞，还是 位于支配松果体的神经纤维，目前仍不十分确切。人们普遍认为，肽类激 素分泌颗粒，是以胞吐分泌的方式释放；但也有学者认为，肽类激素分泌 颗粒的释放形式，可能存在连同颗粒被膜的整体释放。由于松果体的毛细 血管为窗孔型，相对缺乏血脑屏障，故多数学者认为，松果体细胞释放的 分泌物，立即进入血液循环；也有学者认为，松果体分泌的褪黑素，可以 直接释放到第三脑室或蛛网膜下隙的脑脊液中。对人和牛等的血液和脑脊 液中，褪黑索浓度的分析表明，脑脊液中浓度通常高于血液数倍；所以， 褪黑素有可能被直接释放入脑脊液，从而最快最有效地到达脑内的作用靶 点。本研究课题，旨在探讨松果体肽类激素的化学性质和释放形式，观察 松果体分泌物直接释放到蛛网膜下隙脑脊液途径的结构基础；为进一步阐 明松果体的功能，也为临床相关疾病的诊治，提供形态学依据。 一、大鼠松果体细胞原代培养体系的建立 目的：建立体外培养的大鼠松果体细胞系，观察培养的松果体细胞在 生长、增殖和功能状态等生物学方面的变化，探讨培养松果体细胞的最佳 生长和功能状态时机，为摆脱神经及体液等因素对松果体的影响、揭示松 果体细胞自身合成和分泌肽类激素，提供实验研究依据。 方法：于春季上午9：00～10：00，将颈椎脱臼法处死的生后1~3天 SD乳鼠，经75％乙醇消毒后，将颅骨骨片向前掀起，游离粘连于颅骨上 的松果体浅部，剥除脑膜及血管；将松果体剪碎，离心后加入0．125％胰 化，制备成单细胞悬液；接种于放有盖玻片的六孔板中，置于37℃含 5％C02饱和湿度的培养箱内，在上述混合培养基中培养；分别在接种后 的第3、7、10、13天，半量更换混合培养基。每天定时在倒置显微镜下 中文摘要 观察其生长情况；取培养第12天的细胞爬片，行免疫细胞化学染色，4％ 抗体工作液，4。C过夜；二抗为生物素标记的羊抗兔IgG工作液；应用辣 根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液、DAB显色；采用0．125％胰酶和 0．02％EDTA混合消化液消化法，取培养到第15天的细胞，2％多聚甲醛 和2．5％戊二醛混合固定液，4。C固定3h，进行常规TEM样品的制各与观 察；取培养第15天的细胞爬片，l％戊二醛4。C固定1h，梯度乙醇脱水， 自然干燥后镀金，SEM观察。 结果：在倒置显微镜下观察显示，在接种6h后，培养细胞贴壁；接 种后的4天内，贴壁细胞增殖缓慢；接种后第5-6天，细胞增殖加快；在 接种后的第7～8天，出现典型的培养细胞巢，为较暗的圆形、椭圆形、三 角形或多角形的松果体细胞；在成纤维样细胞层的上方中央，呈铺路卵石 样密集排列；第8～12天，细胞增殖旺盛，形成许多面积大小不一、细胞 数量不等的细胞巢；在第12～15天，分散的、呈片状的成纤维样细胞层逐 渐融合，其上的细胞巢内呈铺路卵石样排列的细胞逐渐分散，细胞巢变得 不典型。在细胞巢的周边和细胞巢的空穴内，可见少量胞体较大、突起粗 大的多边形神经胶质样细胞。在培养第12天的细胞爬片上，可见5-HT 免疫反应阳性细胞，外观似双极神经元。TEM观察显示，体外培养15天 的松果体细胞内，有丰富的粗面内质网和游离核糖体、密集的线粒体、少 量直径300nm左右的膜包密芯分泌颗粒；在细胞质内，还可见到许多大 小不等的囊泡。在体外培养15天的细胞爬片上，SEM观察显示，可见梭 形和近似球形的松果体细胞。 结论：实验建立了大鼠松果体细胞体外培养体系，方法简单易行、价 格低廉。在培养的第7～8天，出现典型的细胞巢，为较暗的圆形、椭圆形、 三角形或多角形松果体细胞，位于成纤维样细胞层的上方中央，呈铺路卵 石样密集排列。培养10～15天时，细胞生长状况较好，是进行免疫细胞 化学研究，或做透射电镜观察的最佳时机。 二、大鼠松果体内生长抑素免疫反应阳性细胞和纤维的观察 目的：由于松果体细胞带有突起，又含有分泌颗粒；而且，支配松果 体的神经纤维，也可以释放神经肽。然而，松果体内的