水稻热激蛋白Hsp90基因的克隆及互作蛋白的筛选.pdfVIP

摘 要 逆境胁迫(如低温、高温、干旱、高盐等)会引起植物体内发生一系列的生理反 应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至引起不可逆伤害，导致整个植株死 亡。在逆境条件下，植物可以利用体内的一些已有蛋白或新合成的一些蛋白，来维持 正常条件下才能进行的一些新陈代谢。由于这些蛋白对植物度过逆境具有非常重要作 用，因此通称为植物逆境蛋白，是当今分子生物学、蛋白质组学和植物抗逆生理的一 个重要研究内容，其中心问题是逆境蛋白的生物学功能。近年来，随着分子生物学理 论和技术的渗透，逆境蛋白的研究有了很大进展，一些编码逆境蛋白的基因己被分离。 全面深入地认识逆境蛋白的生理机理，准确掌握逆境蛋白在植物体内的理化性质及生 物学功能，将有助于了解植物对逆境的适应机制，对植物抗逆品种的筛选和培育等具 有指导意义。 热激蛋白(HeatShock Protein，Hsp)是一类在逆境胁迫特别是高温胁迫诱导下， 生物体内生成的高度保守的逆境蛋白家族，是目前发现的主要分子伴侣蛋白之一，直 接参与并促进细胞内蛋白质从初生链的合成到多亚基复合体折叠、装配等整个生物过 程。目前，Hsp在动物中研究居多，而植物中研究较少。本研究主要以水稻热激蛋白 Hsp90作为研究对象，利用酵母双杂交系统筛选其互作蛋白，为进一步研究OsHsp90 的功能，尤其是作为分子伴侣的作用机制打下基础。主要研究结果如下： 1、采用荧光差异显示(FluorescentDifferemial (含O．1％H．A．Yellow)再分离与大矩阵筛选相结合的方法，发现一个水稻热激蛋白 Hsp90差异片段。经RACE．PCR克隆其cDNA全长，拥有2408 bp碱基，编码一个具 有699AA残基的多肽，其中，第2卜35 AA残基是Hsp90家族的保守序列，第28 一182AA残基是一个ATPase结构域，第185—699 AA残基是Hsp90结构域，命名 11810)。 为OsHsp90(GenBank登录号为ABl 2、利用酵母双杂交系统筛选OsHsp90的互作蛋白，特别是筛选结合位点位于 ATPase结构域之外区域的互作蛋白。经严格筛选，共得到13个阳性菌落。其中结合 位点位于ATPase结构域之后区域的有3个。测序后经氨基酸序列比对，共发现4个 rich 互作蛋白： (1)富含脯氨酸蛋白(rice AA残 prolineprotein，OsPRP)，含416 基，第54-412AA残基是一个富含脯氨酸区域；(2)氨甲酰磷酸合成酶核蛋白体(rice small AA subunit)，含462AA残基，第75—222 putativecarbamoylphosphatesynthetase 残基为氨甲酰磷酸合成酶结构域，第261--462AA残基为谷氨酰胺转移酶I结构域； (3)转氨酶IV(riceaminotransferoseIV)，包含361AA残基，第244—273AA残基 是转氨酶Ⅳ的保守序列，第68—343 AA残基是转氨酶Ⅳ结构域，且该蛋白在OsHsp90 的ATPase结构域之后区域存在结合位点；(4)一个水稻推定蛋白，未发现任何已知 功能域存在，功能未知。 3、根据筛选出的互作蛋白的特点，初步讨论了OsHsp90在其互作蛋白发挥主要 生理功能的过程中可能起到的作用。 关键词：水稻，逆境，克隆，OsHsp90，ATPase结构域，酵母双杂交，蛋白互作 2