DF-1细胞二维电泳方法的建立.pdfVIP

第 36卷 第 2期 河 南 科 技 大 学 学 报 ：自然 科 学 版 V01．36 NO．2 2015年 4月 JournalofHenanUniversityofScienceandTechnology：NaturalScience Apr． 2015 文章编号 ：1672—6871(2015)02—0083—05 DF-1细胞二维 电泳方法的建立 范忠军 ，胡序明 ，郁 川 ，秦爱建 ，王欢莉 (1．扬州大学 江苏省动物预防医学重点实验室，江苏 扬州 225009；2．盐城师范学院 生命科学与技术学院，江苏 盐城 224002) 摘要 ：为了建立和优化 DF—l细胞二维 电泳方法 ，对 5种细胞裂解液进行 了比较 ；同时 ，还对提取的蛋 白在不 同 的等 电聚焦条件 、水化条件 、蛋 白上样量、SDS一聚丙烯酰胺凝胶浓度条件下的二维 电泳 图谱进行分析 比较 ，并 用 PDQuest软件分析优化选择 。建立 了DF一1细胞 的二维 电泳方法 ，获得分辨率和重复性均可满足分析要求 的DF一1细胞 的二维 电泳 图谱 。 关键词 ：DF一1细胞 ；二维 电泳 ；裂解液 ；蛋 白质组学 中图分类号 ：$858．31；Q51 文献标志码 ：A 0 引言 二维电泳是蛋 白质组学研究的核心技术之一 ，是 目前唯一能够在一块胶上连续分离数千种蛋 白质 的方法 ，被广泛应用于生命科学研究的各个领域 。在禽病毒病研究领域 ，由于二维电泳 的应用 ，人 们对新城疫病毒 、马立克病毒 、禽 网状内皮组织增生症病毒等的感染机制都有 了新 的认识 。 DF一1细胞来源于 10El龄 EV-0鸡胚的成纤维细胞 ，是 自发永生化的细胞。由于新城疫病毒、马立 克病毒 、禽白血病病毒等禽类病毒均可以在该细胞上复制扩增 ，所以，建立 DF一1细胞的二维 电泳方法为 后期研究病毒感染细胞的差异蛋白质组学研究奠定了基础。 然而，二维 电泳从一维等电聚焦到二维凝胶电泳整个试验过程 比较长，中间每环节都会影响图谱上 蛋 白点的分布 ，并最终影响质谱分析的可靠性和准确性。能够得到蛋白分离率高、重复性好 的二维电泳 图谱并不容易。本研究 以DF．1细胞为研究对象，从样品制备、聚焦时间、水化条件 、上样量和二维凝胶 浓度等方面进行优化 ，最终建立 了蛋白点展现较为理想的DF．1细胞二维电泳方法。 1 材料与方法 1．1 主要试剂 三正丁基膦 (TBP)购 自Bio—Rad公司；3-[(3一胆酰胺丙基)一，二乙胺]一1一丙磺酸 (CHAPS)购 自AMRESCO公司；DNaseI购 自Sigma公司。 1．2 主要仪器 PROTEANIEFCell等电聚焦仪、PROTEANIIXi垂直电泳槽和 PDQuest8．0．I图像分析软件均购 自 Bio—Rad公司。 1．3 细胞总蛋 白的提取 用橡胶刮刮下处于对数期 的细胞 ，用预冷 的磷酸盐缓冲溶液 (PBS)清洗 2遍 ，4oC、500g离心 5 min。收集的细胞按1×10个细胞加人 500 L裂解液中(见表 1)，冰浴作用30min，期间震荡2—3次。 冰浴下超声波裂解 ，使用电流 30A，超声 3min，间隔 10s。超声结束后 16℃、12O00g离心60min。转 移上清液分装 ，Bradford方法对样 品蛋白浓度进行定量 ，放入 一70℃冰箱保存。 1．4 二维电泳程序 等电聚焦使用 pH3-10NL的 17em IPG胶条 ，取 300Ixg蛋 白样品溶解于水化液 中，终体积为 330 基金项 目：国家 自然科学基金联合基金重点项 目(U0831002)；国家行业专项基金项 目(200803019) 作者简介 ：范忠军(1978一)，男，江苏盐城人，讲师，博士，主要从事动物疫病方面的研究． 收稿 日期 ：2014—07一O1 · 84 · 河 南 科 技 大 学 学 报 ：自然 科 学 版 L。等电聚焦程序 (20oC)：50V主动水化 14h；250V，慢速 ，2h；500V，慢速 ，1h；1kV，线性 ，1h；8 kV，线性，