草莓乙烯受体FaEtr2基因RNAi植物表达载体构建及其遗传转化分析.pdf

摘要 草莓是一种经济价值很高的果品，但果实采后极易软化腐烂，不耐贮运，造成很 火的经济损失。乙烯受体FaEtr2基因在草莓果实成熟阶段大量表达，可能与果实的 成熟密切相关。深入研究FaEtr2基因功能将有助于揭示乙烯受体与非跃变型果实成 熟的关系，从而为采用生物技术手段提高草莓果实的贮运性能奠定基础。为此，本研 构建了该基冈的反义和RNA干扰植物表达载体。以全明星草莓组培苗叶片为试材， 研究了基本培养基、激素配比、外植体生理状态、苗龄、暗培养时间等，对草莓不定 芽再生的影响，优化了草莓再生条件，获得了草莓高效再生体系。通过叶盘与农杆菌 结果如下： (一)全明星草莓FaEtr2基因克隆及表达载体构建 100％，无内含子序列。说明克隆到的片段是全明星草莓FaEtr2基因片段。 XbaI-BamH I和 上的CaMV35S启动子和FaEtr2的反义序列，将其定向插入到切除CaMV35S启动 子的pBIl21质粒中，构建成反义表达载体pBll21．anti．Etr2。 I和SmaI酶切位 (3)将FaEtr2的序列正向插入到中间载体pBl221质粒的BamH I和HindlII酶切构建好的 点之间，构建成中间表达载体pBl221．sense-Etr2。用EcoR 菌LBA4404中，经特异性引物对转化菌液的PCR扩增，证实表达载体己转入农杆菌。 (二)叶片再生体系的建立 (1)对所试的三种基本培养基，MS(1 nN)、 ％和58．86％。以幼嫩叶片为外植体，分化率和平均不定芽位点数分别为35．71％和 者的玻璃化率差异不显著。 (2)随着TDZ浓度的升高，叶片分化率、平均不定芽位点数都呈上升趋势，同时 玻璃化率也呈上升趋势。TDZ 1．0mg·L。1和1．5mg·L。处理叶片分化率(分别为32．98％ 和36．67％)、平均不定芽位点数(分别为0．42和0．47)均较高，但TDZ1．5mg·L叫处 1．0 1．0 理的玻璃化率显著高于TDZ mg·L-1为全明星 mg·L。处理。综合考虑确定TDZ 草莓叶片再生的适宜浓度。 (3)IBA和NAA都是在浓度为O．05mg·L。时再生效果最好，叶片分化率分别为 68．99％和38．93％。0．05 mg．LJ的IBA和1．0mg·L．1的TDZ配合使用是适用于的全明 星草莓叶片再生的最佳激素处理。较高浓度的NAA(O．2 mg·L～-4)．3mg·L_)处理中， 再生的不定芽玻璃化率较高。同水平的IBA与TDZ组合，叶片分化率、平均不定芽 位点数和平均每叶片再生不定芽数均显著高于NAA与TDZ组合。 (4)不经暗培养的叶片再生频率较低，随着暗培养时间的延长，叶片分化率和平均 不定芽位点数都呈上升趋势，暗培养9天和12天的叶片分化率分别为40．54％和 34．29％，显著高于其他处理。 (三)遗传转化体系的建立 (1)Cef200 mg·L-。 mg·LJ时组培茁植株及侧芽生长都基本正常，达到或超过300 植株生长及侧芽分化都受到明显抑制。200 mg·L_Cef可基本抑制农杆菌的生长。Km 20 mg．Lo可抑制非转化芽分化，可用于抗性不定芽筛选。 天的叶片抗性不定芽生成率最高，为18．9％，与其他预培养时间处理问差异极显著； 附加10 mg·LJ或2