拟南芥AtLACS9与AtGPAT9基因的克隆及其大豆的遗传转化.pdfVIP

摘 要 三酯酰甘油（Triacylglycerol, TAG ）是植物油的主要化学成分。脂酰 辅酶A （Acyl-coenzyme A, Acyl- CoA ）和甘油- 3- 磷酸（Glycerol- 3-phosphate, Gly3P ）是合成TAG 的前体。长链脂酰辅酶A 合成酶（Long -chain Acyl-CoA synthetase, LACS ）可催化种子中脂酰辅酶A 的合成。甘油-3- 磷酸酰基转移 酶 （Glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT s ）则催化脂酰辅酶A 中的脂 肪 酰 基 对 甘 油 -3- 磷 酸 分 子 sn- 1 位 的 酯 化 反 应 ， 形 成 溶 血 磷 酯 酸 （Lysophosphatidic acid , LPA ），从而启动TAG 的合成。因此，LACS 和GPAT 是植物种子中TAG 合成的关键酶，直接影响种子含油量。模式植物拟南芥 同时也是高油分植物，目前对其AtLACS 和AtGPAT 基因家族的研究较为深 入，其中AtLACS9 和AtGPAT9 基因在种子TAG 的合成中可能起重要作用。本 论文克隆了这2 个基因并将其中AtLACS9 基因转化大豆，旨在获得油 分含量 提高的转基因大豆。主要研究结果如下： （1 ）将大豆种子凝集素基因的启动子（ lec ）从pBI -lec 载体上酶切下 来，连接到植物表达载体pCAMBIA 3301 （p3301 ）的多克隆位点上，构建 成p3301 -lec 载体。 （2 ）用RT -PCR 方法克隆了拟南芥AtLACS9 基因的编码区cDNA ，并将 其连接到p3300 载体的35S 启动子和p3301 -lec 载体的lec 启动子之后，构建成 组成型和种子特异性表达载体。 （3 ）用RT -PCR 方法克隆了拟南芥AtGPAT9 基因的编码区cDNA ，并将 其连接到p3301 载体的35S 启动子之后，构建成超表达载体，然后将其转入 农杆菌，为进一步转化大豆做好了准备。 （4 ）用冻融法将p3301 - lec -AtLACS9 载体转入农杆菌，再用其介导的 子叶节法转化大豆，经筛选获得抗性绿芽和再生植株，目前正在用PCR 方 法进行转基因植株的分子检测。 关键词：AtLACS9 ；AtGPAT9 ；基因克隆；载体构建；大豆转化 Cloning of AtLACS9 and At GPAT9 from Arabidopsis and the Transfomation of Soybean Abstract Triacylglycerol (TAG) is the major form of storage lipid in oilseeds, and acyl-coenzyme A (Acyl-CoA) and glycerol- 3-phosphate (Gly3P) are precursors for the bio synthesis of TAGs. Long-chain Acyl-CoA synthetase s (LACS s) catalyze the synthesis of acyl -CoA. Glycerol- 3-phosphate acyltransferase s (GPAT s) catalyze the acylation of glycerol - 3-phosphate at the sn - 1 position with the Acyl group from Acyl-CoA and result in the formation of lysophosphat idic acid(LPA) , which is the initial step of TAG biosynthesis. Therefore , both AtLACS