Parkin对过表达Synaptotagmin+Ⅺ诱导细胞死亡与聚集小体形成的抑制作用分析.pdf

题目：Parkin 对过表达Synaptotagmin XI 诱导细胞死亡和聚集小体形成 的抑制作用的研究 作者: 郑汭 导师：陈生弟 教授 学位：硕士 学校：上海交通大学 摘 要 帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是老年人群中常见的神经退行性疾病，以静止 性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势反射障碍为主要临床特征。病理学上可见黑质多 巴胺（DA ）能神经元进行性减少和路易小体（Lewy body, LB ）形成。 囊泡突触蛋白 Synaptotagmin XI 是路易小体的成分，而且是常染色体隐性遗传 性少年型帕金森病(autosomal recessive juvenile parkinsonism ，ARJP) 的致病基因 parkin 所表达的 parkin 蛋白的底物，parkin 是细胞内泛素蛋白酶体系统（Ubiquitin proteasome system, UPS ）中的E3 连接酶，通过将底物的多泛素化使得底物被标记， 随后被26S 蛋白酶体识别并降解，从而避免底物蛋白的堆积，造成对细胞的毒性。 本研究通过构建SytXI 质粒，转染到DA 能PC12 细胞和SH-N-SY5Y 细胞，进行过 表达后，观察对细胞的影响，同时研究SytXI 与Parkin 的关系。实验分为四个部分： 第一部分：SytXI 基因真核表达载体的构建及其在细胞中的表达 设计 SytXI 基因的上下游引物，以人胚脑的 cDNA 文库为模板，采用 PyrobestTMDNA 聚合酶进行 PCR 反应。将获得的 SytXI 基因连接到 pcDNA3.1myc-His(-)B 质粒中，经过双酶切和测序验证重组质粒，然后将重组质粒转 染PC12 细胞，提取总蛋白western blot 验证有SytXI-myc 融合蛋白的表达。 第二部分：Parkin 对过表达SytXI 诱导细胞死亡的抑制作用 利用四甲基偶氮唑盐(MTT) 比色法检测细胞活性，结果为PC12 和SH 这两种细 胞在过表达SytXI 后，均有细胞活力的下降（PC12 细胞组P0.01 ；SH 细胞组P0.01 ）。 磷脂结合蛋白－碘化丙啶（Annexin V- PI ）双染色检测死亡的细胞，结果显示，过表 2 达 SytXI 引起细胞死亡，而同时有SytXI 和Parkin 过表达的细胞的死亡率显著降低 (PC12 细胞组 P0.01 ；SH 细胞组 P0.01) 。 第三部分：过表达Syt XI 和Parkin 对细胞聚集小体形成的影响 通过免疫荧光检测不同处理下的细胞 vimentin,myc 阳性聚集小体的形成，将细 胞分为三组，一组转染空质粒，一组转染Syt XI，一组共转Syt XI 和Parkin 。在转 染 24h 后进行免疫荧光染色，显微镜下观察，vimentin 阳性的为红色荧光，myc 为 绿色荧光，在不同波长激发荧光下分别拍照，图片合成后，显示的桔黄色重叠部分 为聚集小体，每张片子数200 个细胞，计数聚集小体的数量，重复实验3 次。结果 为转染空质粒基本没有聚集小体，而共转Syt XI 和Parkin 组出现聚集小体的细胞数 要显著低于转染Syt XI 组（PC12 细胞组 P0.01 ；SH 细胞组 P0.01 ）。提示Parkin 可通过降解其底物来减少蛋白的积聚。 第四部分：Syt XI 和Parkin 的相互关系，Parkin 通过泛素化降解SytXI 利用免疫荧光对转染Syt XI 的细胞进行Syt XI 和Parkin 的双染色，通过合成图 片后，发现在两者细胞内存在共定位，提示两者的相互作用。进一步研究Parkin 是 否通过泛素化降解SytXI，将细胞分为二组，一组转染Syt XI，一组共转Syt XI 和 Parkin ，提取细胞总蛋白，western blot 验证了过表达Parkin 可减少Syt XI 蛋白的表 达，表明两者存在某种关系。进一步通过使用26S 蛋白酶体抑制剂Lactacystin 来阻 止泛素化蛋白的降解，western blot 显示出条带状的