水生生物致病性弧菌检验.docVIP

ICS65.150 B50 DB32 江苏省地方标准 DB 32/ T XXXX—XXXX 水生生物致病性弧菌检验 Examination of pathogenic vibrio in aquatic organism 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 江苏省质量技术监督局发布 前言 本标准的附录为规范性附录。 本标准由江苏省海洋与渔业局提出。 本标准由江苏省管理。 本标准按GB/T1.1–2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》要求进行编写。 本标准起草单位：江苏省水生动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：方苹、陈辉、倪金俤、陈静、刘训猛、郭立新、袁锐。 水生生物致病性弧菌检验 范围 本标准规定了致病性弧菌检验的和材料、培养基和试剂、检验程序、操作步骤。 本标准适用于水生生物中致病性弧菌的检验。 规范性引用文件 下列文件本。凡是注日期的引用文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 和材料 除微生物实验室常规灭菌和培养设备外，其他设备和材料如下：冰箱：0～4。 恒温培养箱：36±1℃，28℃±1℃。 显微镜：10～1×，物镜：40～100×。 均质器或灭菌乳钵。 电子天平：0.g～500.0 g精度0.1 g。试管：16mm×160mm、15mm×100mm及相应的试管架。 ：1mL（具0.01mL刻度）5mL、10mL（具0.1mL刻度）。 锥形瓶：500 mL250 mL。 培养皿：直径90mm。 培养基和试剂 3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW）：按附录。 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：。 3%氯化钠胰蛋白胨大豆（SA）琼脂：。 嗜盐性试验培养基：。 3%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：。 3%氯化钠甘露醇试验培养基：。 3%氯化钠MR-VP培养基：。 ONPG 试剂：。 氧化酶试剂：。 革兰氏染色液：。 科玛嘉弧菌显色培养基 。 API 20E生化鉴定试剂盒或其他等效产品。 样品的采集与处理 采样数量 对疑似或有临床症状的水生动物，挑选3-5，至少不低于2条濒死的个体；对无症状的水生动物，按SC/T 7103的规定，随机取一定数量的个体。 采集部位 对疑似或有临床症状的样品，用75%酒精棉球擦拭表面后，在无菌条件下，取的病灶或肝、肾、脾于3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌。对无症状样品在无菌条件下取肝、肾、脾于3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌。 检验程序 致病性弧菌检验程序见图1。 致病性弧菌检验程序 操作步骤 增菌 以无菌操作取检样加入3%氯化钠碱性蛋白胨水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，于36±1℃培养18h～24h后取出观察若检测鳗弧菌于28±1℃培养18h～24h后取出观察。 分离 所有显示生长的试管或增菌液用接种环沾取一环，于TCBS琼脂平板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上划线分离。一个试管划线一块平板，于36±1℃培养18h～24h若检测鳗弧菌于28±1℃培养18h～24h。 圆形、半透明、表面光滑副溶血性弧菌 V.parahaemolyticus 溶藻弧菌 V.alginolyticus 创伤弧菌 V.vulnificus 河流弧菌 V.fluvialis 拟态弧菌 V.mimicus 鳗弧菌 V.anguillarum 纯培养 挑取三个或以上可疑菌落，划线平板，36±1℃培养18h～24h若检测鳗弧菌于28±1℃培养18h～24h。 氧化酶试验：挑取纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，致病性弧菌的氧化酶为阳性。 涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。致病性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽孢。 鉴定 生化试验：取纯培养物分别接种含3%氯化钠的赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、V-P、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、甘露醇、ONPG以及0%、3%和10%三个不同氯化钠浓度的胰胨水中，36±1℃培养18h～24h后观察结果若检测鳗弧菌于28±1℃培养18h～24h。各致病性弧菌的生化性状见表。 API 20E生化鉴定试剂盒或其他等效产品：刮取3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，用生理盐水制成浊度适当的细菌悬浮液，使用API 20E生化鉴定试剂盒或其他等效产品鉴定。 检验结果 当检出的可疑菌落生化性状符合表API 20E生化鉴定时，报告样品检出相应的致病性弧菌。 致病性弧菌的生化性状+”表示阳性，“-”表示阴性） 名称 氧化酶 赖氨酸 精氨酸 鸟氨酸 V-P 蔗糖 乳糖 阿拉伯糖 D-甘露醇 ONPG 嗜盐性试验氯化钠含量/% 0 3 1