pcr技术检测儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的研究.pdf

摘要 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、菌血症、小肠结肠炎，并可能引起 神经功能紊乱，造成严重的后遗症，死亡率高达20％--50％以上，引起世界范围 内的广泛关注。通过研究发现婴儿配方奶粉是其主要的感染源。传统方法操作繁 琐，检测时间长，且灵敏度较低。本研究利用FTA滤膜与PCR技术相结合的方法 建立了一套从婴儿配方奶粉中快速检出阪崎肠杆菌的方法，缩短了阪崎肠杆菌的 检测时间，提高了灵敏度。 本研究以阪崎肠杆菌的16SrRNA基因为靶基因，选择特异性引物，进行PCR 扩增，检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌。对PCR反应体系中镁离子浓度、引物 添加量及退火温度和循环数进行优化，以确定适宜的PCR反应体系和扩增程序， 10xPCRbuffer，4 其适宜反应体系为：61aL gLdNTPs混合物，2．5 M92+此(25mM)， 10 2此10gmol正向引物，2¨LIxmol反向引物，0．25此(5U／IxL)Taq，23．25IxL 水，总反应体系为50江；其适宜的PCR扩增程序为：PCR反应采用冷启动，95℃ 预变性5mira变性95℃1mill～退火6l℃0．5min进行35个循环。PCR反应产 物在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果。对扩增产物进行了 测序，PCR扩增产物序列与文献报道的靶基因序列的同源性达100％，从而证实 PCR扩增产物确为目的扩增产物。本研究共检测了16株菌，以验证引物的特异 性，结果表明：4株阪崎肠杆菌均为阳性结果；12株其它菌株均为阴性结果。因 此该引物特异性强，可用于检测阪崎肠杆菌。 采用FTA滤膜制备模板进行PCR扩增，其方法的灵敏度为7x101cfu／mL。 采用FTA滤膜制备模板，利用PCR技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌， 以确定检出限。结果表明，经过4h增菌后婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检出限 为7×100 cfu／1009。可在6h内完成对婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检测，比目Iji『 普遍采用的传统检测的方法缩短了12～22h。 比较了检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的6种模板制备方法，结果表明FTA 滤膜法可高效从样品中提取阪崎肠杆菌DNA，可有效的消除PCR反应的抑制因 子，灵敏度高、操作简便、耗时短，该方法明显优于其他方法。 对实际样品进行检测，将本方法与行业标准SN／T1632．1．2005方法进行比 较，确定本方法敏感性为100％，特异性为98．2％符合率为98．2％。 本研究方法使用FTA滤膜法制备模板DNA，可高效的提取样品中的DNA， 有效的消除PCR反应抑制因子，操作简便，为PCR快速检测食品中的致病菌构 建了一个技术平台。 关键词：PCR；检测FTA滤膜：阪崎肠杆菌：婴儿配方奶粉 for on ChainReaction DetectionofEnterobacter StudyPolymerase Assay in PowderInfantFormulaMilk sakazakii Author：ChenShanshan and Major：Foodprocesspreservingengineering Wei Zhang Supervisor：Professor Abstract an Enterob