单核细胞增生李特氏菌胶体金免疫层析方法的建立.pdfVIP

摘要 摘要 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogens，LM)是一种重要的食源 性致病菌，世界卫生组织(WHO)将其列入重点检测的四大食源性致病菌之一。 LM能引起人类和动物李斯特氏菌病。人和动物感染LM可引起单核细胞增多症、 脑膜炎、败血症和流产，严重威胁人类健康和社会经济的发展，同时也造成巨 大经济损失。因此，加强食品中LM检测工作，建立一种快速、简便的筛查方 法具有重要的意义。本研究旨在建立一种简便的、特异性强的针对食品中LM的 胶体金免疫试纸条检测方法。 本研究分别用0．3％福尔马林灭活的LM菌体和超声波破碎的菌体碎片免疫 日本大耳白兔制备多克隆抗体。获得的多克隆抗体效价均达300000，与金黄色 葡萄球菌、阪崎肠杆菌、福氏志贺氏菌有交叉反应。多克隆抗体用辛酸．硫酸铵 法和磁珠吸附法纯化后纯度明显提高。以酸溶碱沉法提取的LM鞭毛蛋白作为 免疫原免疫Balb／c小鼠制备单克隆抗体。通过间接ELISA方法对Balb／c小鼠脾 脏细胞和SP2／0骨髓瘤细胞的融合细胞培养上清进行检测，筛选到6株阳性融合 细胞，但6株阳性融合细胞经过第一次亚克隆后转为阴性，最终没有筛选到能 够稳定分泌单克隆抗体的融合细胞株。 本研究用两株可配对的抗LM单克隆抗体，建立了特异性检测LM的胶体 金免疫层析方法。抗LM单克隆抗体标记胶体金颗粒，醋酸纤维素膜上分别包 被另一株抗LM单克隆抗体和驴抗鼠二抗作为检测线和控制线，组装成胶体金 免疫层析试纸条。最终确定的生产工艺参数为：胶体金颗粒粒径为40nm左右， 抗LM单克隆抗体A标记量为20¨g／(mL胶体金溶液)，标记时pH值为8．1， 检测线上抗LM单克隆抗体B浓度为2．0 mg／mL，控制线上驴抗鼠二抗浓度为 1．0 CFU／mL。对 mg／mL。在此工艺条件下，对LM纯培养物的检测灵敏度为107 I和4b血清型的LM均可检测，与同属的绵羊李斯特氏菌及属外的大肠埃希菌、 金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌等菌无交叉反应。在实际食品样本添加LM，经李 氏菌增菌液选择性增菌48h后试纸条检测结果为阳性，并用OXA平板涂布计数 验证结果正确。通过37℃加速保存实验，试纸条保质期可达15个月。 本研究成功地研制出特异性检测LM胶体金免疫层析试纸条，该试纸条具 n 摘要 有结果容易判定、特异性强、稳定性好、操作简单的优点，可满足基层单位大 批量检测。 关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；多克隆抗体；单克隆抗体；胶体金免疫试 纸条 m Abstract ABSTRACT Listeria oneofthemostvirulentfoodbome monocytogenes(LM)is pathogens， whichhasbeenlistedasoneoffourmonitoredfoodborne byWHO．LM pmhogens caninfeCtboth and causelisteriosis．Commonclinical humanother animals，and oflisiteriosisinclude syndromes andstillbirths．LMmenace onhumanhealthandthe of seriously devel