力学环境下组织程骨的构建与动态培养.pdf

中文摘要 力学环境下组织工程骨的构建与动态培养 博士研究生：陈学忠 指导教师：张西正 摘 要 目的： 1．依据仿生原理制备一种新型的胶原多糖基纳米HA复合骨支架材料，并与成 骨细胞复合培养，检测其细胞相容性，为其将来在骨组织工程中和临床上的应 用提供实验依据。 2．设计并构建一套用于组织工程骨或骨组织在体外三维灌流培养和动态载荷生 物反应器并测试其性能，为体外组织工程骨的动态培养和三维条件下进行骨细 胞生物力学研究提供一种可靠的培养装置与研究平台。 3．初步研究组织工程骨在循环灌流和动态压应变载荷下的力学效应，从而为考 察力学刺激在组织工程骨的构建和培养过程中的作用机理，以及为将来进一步 从细胞和分子水平方面研究各种压应变载荷条件下的细胞生物学行为与作用机 理提供一些实验参考依据。 方法： 1．称取6．09牛I型胶原与600mg透明质酸钠(胶原与透明质酸钠的质量比为 10：1)，用0．1％稀醋酸稀释，在室温下搅拌混合30min。加入碳化二亚胺 【1-ethyl-3-(3-dimethyl 9．1)，lmol／L的NaCl清洗，去离子水 用40％的酒精、0．1moUL的Na2HP04(PH 漂洗10遍。以胶原分子与透明质酸交联的产物为模板，调制钙磷盐在液相中沉 积其上，得到矿化胶原多糖基复合材料(nHACP)。采用液相分离法与少量聚乳酸+ 复合进一步制备成为三维多孔支架材料(nHACP／PLAscaffold)。用x．ray衍射、 中文摘要 扫描电镜等对材料成分和支架形貌进行分析和测试，观察和测量支架的孔径、 孔隙率和交通孔的大小。测定37℃下支架材料的2h吸水率。用万能材料测试机 测定支架在饱和湿度条件下的抗压强度和经体外降解1、10、20d后的力学性能 改变。 2． 将成骨前体细胞MC3T3．E1直接接种到胶原多糖基纳米H．A复合骨支架支 架材料上，培养液为a-MEM培养基，加入10％胎牛血清，100 mg／L青霉素和 盒(Cell Kit-8，CCK-8)检测材料上成骨细胞生长、增殖情况。测定支 Cuonting 架上MC3T3．E1细胞内的碱性磷酸酶(ALP)活性，并与在培养皿上培养的细胞作 对照比较。用倒置相差显微镜、组织化学染色、荧光显微镜、扫描电镜等观察 细胞在支架材料上的生长形态和细胞外基质分泌情况。 3．设计一套动态载荷与循环灌流生物反应器系统。首先明确动态载荷与循环灌 流生物反应器的设计原则；分别设计了应变加载系统和三维灌流培养系统。应 变加载系统由刚性框架、智能型封装压电陶瓷置和压电陶瓷伺服器构成；三维 灌流培养系统由培养舱、培养液储存罐、多通道双向蠕动泵和连接管组成；设 计供三维灌流与加载专用的培养舱。按设计方案构建一套生物反应器样机，装 配并运行反应器系统后进行测试：①置于5％C02和37℃恒温培养箱内，每天移 至超净台中进行应变加载2h，连续运转5d，每天抽取培养液加入到血培养瓶中 作细菌培养，测定其无菌性能；②分别测定蠕动泵的单个灌流通道在不同转速 时的平均流量；③将组织工程支架试件装入培养舱内，移至压电陶瓷加载装置 上实施加载，发送各种指定的频率、位移和工作时间等指令，观察并记录计算 机操作界面中实时显示所采集到的频率、位移和波形和工作时间等实际工作数 据与设定数据的偏差，检测反应器系统运行的稳定性和可靠性。 培养基加入10％的胎牛血清(FBS)进行培养，置于37℃、5％C02培养箱中。 4h后将组织工程化模块进行分组，静态培养组：培养物置于直径10ram的培养 皿内静态培养；灌流培养组：培养物置于生物反应器培养舱内灌流培养，灌流 Ⅱ 中文摘要 速度为以10mL／mim灌流培养+应变加载组：在灌流培养组的基础上对培养物 细胞计数试剂盒(Cell Cuonting 料上成骨细胞的吸光度(OD值，X=450rim)。于培养后10d取出各组培养物。测 定各组细胞内碱性磷酸酶mP)活性。采用组织切片和扫描电镜