琯溪蜜柚汁胞发过程的差异蛋白质组学研究.pdf

福建农林大学博士论文 摘要 摘 要 蛋白质组学是后基因组学的主要内容之一，近年来得到了迅速发展，在生物 分子的分析方面广泛应用。本研究以珀溪蜜柚(Citrusgrandiscv．Guanximiyou)汁 胞为材料，利用双向电泳、质谱技术，对珀溪蜜柚汁胞不同发育时期进行了差异 蛋白质组学的分析。建立了适合瑭溪蜜柚汁胞蛋白质组学研究的技术平台。获得 与汁胞发育、成熟和衰老相关的差异蛋白质，进行了差异蛋白质组分析和生物信 息学的研究，并对其中的部分差异蛋白质进行eDNA克隆及原核表达分析。主 要研究结果如下： 1．建立了适合瑁溪蜜柚汁胞蛋白质分离的、稳定性好、分辨率高的双向电泳技 术体系，对汁胞发育不同时期和不同粒化程度的蛋白质组差异进行比较。汁胞共 检测到1037+60个蛋白质点，其中有100个蛋白质点在不同发育时期上调表达， 217个蛋白质点下调表达，完全特异的蛋白质点有85．511个；有108个蛋白质 点在不同粒化程度中上调表达，107个蛋白质下调表达，约400个完全特异的蛋 白质点。 2．选取瑁溪蜜柚不同发育时期的汁胞50个差异蛋白质点进行MALDI．TOF／TOF 质谱分析，48个获得了完整的肽指纹图谱，将肽段数据导入NCBInr Viridiplantae 蛋白质数据库，用MASCOT搜索鉴定出24个蛋白质点；通过生物信息学分析， 根据蛋白质的功能可以把他们划分为调控蛋白，转录因子，能量代谢，细胞骨架， 防卫反应，代谢酶，以及未知功能的蛋白质。另外有10个只能在柑橘EST中得 到鉴定。蛋白、核酸和EST序列数据库的综合应用提高了蛋白质鉴定的成功率。 还有一些差异表达没有鉴定成功可能与现在的蛋白质数据库不够全面有关。选取 析，其中27个获得了完整的肽指纹图谱，将肽段数据导入NCBInr Viridiplantae 和NCBICitrusEST数据库进行检索，鉴定出19个蛋白质点，其中有8个只能在 柑橘EST中得到鉴定，通过生物信息学分析是关于转录活性因子蛋白、GTP结 合蛋白、Hsp70、APX、温度诱导脂质运载蛋白和Actin。 EST序列匹配 3．鉴定出的差异蛋白质点G6能够与序列号gilatrus 福建农林大学博士论文 摘要 Blast和DNAMAN同源性比较分析，推测其是一个Germin．1ike protein。Germin 蛋白的多糖部分为HS．GGAX，是细胞壁半纤维素的直接前体，与植物细胞壁伸 展性的增加密切相关，同时，Germin具有草酸氧化酶活性。推测Germin通过控 制细胞壁的伸展性在瑁溪蜜柚汁胞的粒化中起作用。 4．质谱鉴定结果中有3个和APX匹配的差异蛋白质点，表明APX与汁胞发育(粒 化)是密切相关的。为此，对APx在汁胞发育过程和不同粒化程度中的活性动态 和分子克隆方面作了进一步的研究。 (1)选取不同发育时期的馆溪蜜柚汁胞进行它们的APX活性测定及同工酶分析， 随着成熟度的增加，APX活性成一个上升趋势，到果实成熟时趋向稳定。取不 同粒化程度的汁胞进行它们的APX活性测定及同工酶分析。APX与汁胞发育是 密切相关的，同时发现粒化样品的APX活性随着粒化指数的提高而变大。 (2)根据己克隆的其他植物的APX基因的保守序列设计引物，采用同源克隆的方 法从瑁溪蜜柚汁胞中获得了APXlcDNA片段，根据获得的cDNA片段的序列设 8 cDNA 计RACE引物，通过RACE法获得了全长为11l bp的瑁溪蜜柚汁胞APXl 全序列，包含750bp的开放读码框，编码250个通读的氨基酸序列