甘蓝esrk重体、突变体的构建及其与scr相互作用单倍型的研究.pdf

甘蓝esRK重组体、突变体的构建及其与scR相互作甭覃甭 型的研究 蔬菜学博士研究生韦静宜 指导教师王小佳 摘要 交机制，而自交不亲和信号传导题耕究植物胞间信号传导的模式系统。sI反应在十 字花科中表现为自我或自我相关的花粉在柱头表面的萌发抑制。这个反应是由发 生在柱头表面的受体-配体相互作用所激发的。该受体是一种跨膜的丝氨酸／苏氨酸 受体激酶称为S．位点受体激酶(S．10cus receptor 柱头表面的细胞膜乳突纽胞中。SIⅨ胞外域(eSRK)主要是负责配体结合，在单 倍型间呈现高度多态性，是个S特异性决定因子。SRK配体被称为S位点富含半胱 氨酸(S 异性结合导致自我花粉被拒绝。 迄今为止，还没有实验研究出sRK的单倍型特异性的决定因素，生物信息学的 预测为这一命题带了各种各样的假说。eSRK(SRK胞外域)负责配体结合，根据 序列相似度可以将esRK分成三个子域。N．端类似于甘露糖结合凝集素(B．Le鲥on Domain)，中间的高变区包含了与单倍型特异性相关的大量变异，c．端是相似最 高的PAN或APPLE域，参与蛋白质一蛋白质或蛋白质．碳水化合物的相互作用。研究 这些区域被认为是平衡选择的产物。据推测，高变区中一些多态氨基酸是在自然 选择和植物理化性质发生改变的情况下获得，这或许可以解释新S单倍型是如何演 变而来。序列分析表明，SCR就是结合在SRK高变区上。 在育种实践中，自交不亲和系已经成为重要育种材料，因此开展自交不亲和性 相关研究具有重要的理论价值和现实意义。为探索eSRK序列上参与配体结合及相 互作用的区域，我们以结球甘蓝高代自交系E、F为材料，构建了3个甘蓝不同单倍 型的eSRK基因重组体，利用酵母双杂交系统检测各个重组体与SCR的相互作用。 我们进一步分析了SRK高变区上的多态性位点，筛选出9个多态性较高的位点，对 其进行突变，希望获得在s砌osCR单倍型特异性相互作用中起决定作用的氨基酸 位点。 l植物材料自交不亲和性的分析 为了鉴定本试验所使用的植物材料一结球甘蓝材料E、F的自交不亲和性， 我们采用荧光显微法观察了两种材料花期自交及杂交后花粉管萌发情况，并测定 了二者花期自交和杂交的亲和指数。结果显示，结球甘蓝材料E在花期自交时仅 有少数(10条)甚至没有花粉管进入柱头，说明结球甘蓝材料E具有自交不亲 和特性。同样的，结球甘蓝材料F在授上自身的花粉后，在柱头中只能观察到少 数(10条)进入柱头组织中的花粉管。结球甘蓝材料E的花期自交亲和指数为 O．23，F花期自交亲和指数为O．19，与多年来的统计数据(未列出)相一致。通过 荧光显微可观察到E、F花期相互杂交后柱头中有大量(25)的花粉管，二者花 期正反交的亲和指数均大于5。表明结球甘蓝材料E、F为强自交不亲和系，并且 杂交亲和。 2甘蓝材料舢和．譬C欠基因的克隆及分析 针对P舒ⅨN端和C端相对保守的序列设计特异性引物eSRKs和eS砌AS，从 柱头CDNA中克隆E、F的P甜K基因，分别命名为僦、e泓。序列分析表 明，僦、麟核酸序列分别与肋黝8、肋．镏K7高度同源，由此判定，E 属于甘蓝S28单倍型，F属于甘蓝S7单倍型。两个e．S!RK的氨基酸序列都包含了 外域绝大部分区域，除了信号肽。根据所获得的单倍型信息设计了克隆．蚴基因 的引物，并顺利从结球甘蓝材料E、F花蕾gDNA中扩增出分别与e舒嗡、麟 同源的SCR基因，命名为．妃‰和瓣。所获得的溉基因编码53个氨基酸， SC魅编码61个氨基酸，两段氨基酸序列均包含了SCR成熟肽的全部氨基酸序列， 其中包含了在所有SCR氨基酸序列中高度保守的1个甘氨酸和8个半胱氨酸。 3甘蓝eSRK中决定其单倍型特异性的肽段的研究 3．1酵母双杂交系统检测SCR与各个eSRK间的相互作用 为了探讨HVI／II区域在SRK单倍型特异性及其与scR互作中的作用，本研 究采用重组技术构建甘蓝不同单倍型丛砌@Z赋E与蚴基因间的重组体： 间的相互作用。 结果显示， mM3．触r平板上生长，其余8个组合在 合能在SD／-His／．Trp／-Lc“Ade／X—a．Ga抛5 In】M3-A