茶树幼根set库构建及茶氨酸代谢相关基因表达分析.pdf

摘 要 茶氨酸系茶树中的特征性非蛋白质氨基酸，是构成茶叶品质的主要成分之一， 影响茶叶的滋味品质，具有重要的保健功能和药理作用。目前与茶氨酸代谢相关的分 子机理还知之甚少。因此，研究茶氨酸代谢途径上相关的基因，特别是茶氨酸合成的 关键酶基因及调控因子等，将为进一步明晰茶氨酸代谢途径及利用转基因生产茶氨酸 提供基础。基于茶氨酸合成于茶树根部以及推定的前体物为盐酸乙胺和谷氨酸钠，作 者先在沙培的龙井 43 茶苗培养介质中添加茶氨酸合成的前体物激活茶氨酸代谢途 径，然后选取茶氨酸合成器官——茶苗幼根作为试材，构建 cDNA 文库并进行 ESTs 测序分析；另一方面，筛选出茶氨酸含量差异的材料，通过实时荧光定量 PCR 初步 分析茶氨酸代谢相关基因的差异表达。为今后构建基因芯片或数字化的基因表达谱来 获取茶氨酸代谢相关的功能基因、调控因子以及深入了解茶氨酸合成及相关氮代谢机 理提供研究基础。具体研究结果如下。 1.由于采用现有的茶树 RNA 提取方法提取茶苗幼根中的 RNA 难以取得良好的效 果，作者在提取茶苗幼根 RNA 的过程中，对几种 RNA 提取方法进行了比较，结果 显示改良的 CTAB 法提取茶苗幼根等组织中的 RNA 完整性好、纯度高，可以满足构 建 cDNA 文库的要求。 2.以茶苗幼根为材料，采用 SMART 技术构建 cDNA 文库并对其质量进行了鉴定。 结果显示该文库的重组率为 92%，库容量为 5.0×105 ，平均插入片段长度超过 1 kb， 可以满足后续的大规模测序等要求。从文库中随机挑选克隆并从 5 ’端单向测定5160 个克隆，获得 4860 个有效的 ESTs ，序列长度从 100 至 1850 bp，平均长度为 617 bp （部分序列已登录GenBank，登录号为 GE652554–FE861258 ）。用 Phrap 软件进行拼 接，共获得 1809 个 unigenes ，其中，648 个为 contigs，1161 个为 singletons；与NCBI 的非冗余核酸数据库进行 BlastX 比对以及 Blast2go 注释，将已知或推定的功能基因 进行了分类，并通过 Kegg 分析其中涉及到次生代谢及氨基酸代谢相关的基因。结果 显示，1041 个 unigenes （57.6% ）相似于已知或推定功能的蛋白（E-value＜1E-5）， 282 个（15.5%）相似于未知功能的蛋白，486 个（26.9% ）没有比对上任何蛋白，推 定为新的表达基因。将比对上的编码已知或推定功能蛋白的基因进一步分类，蛋白质 合成类别占 13.06%，与防卫相关的为 8.84%，转运蛋白占 8.65%。 与次生代谢相关 的功能基因占 4.52% ，其中测到序列数量最多的为编码细胞色素 P450 的功能基因， 共有 7 个；此外，还有编码黄酮3-O-葡糖基转移酶、类黄酮3-葡糖基转移酶、p-香豆 酰辅酶A三羟化酶、花青素 5-O-葡糖基转移酶、松柏醇酰基转移酶及咖啡酰辅酶A-O- 甲基转移酶等基因。Kegg pathway 分析结果显示，与次生代谢相关的基因主要参与类 I 黄酮、异黄酮、苯丙素、萜类化合物、二萜、花青素、黄酮和黄酮醇的生物合成代谢 途径，其中最主要的是涉及黄酮代谢途径。与初级代谢相关的基因为 17.39%，其中氨 基酸相关的基因中有涉及氮代谢和茶氨酸合成的谷氨酰胺合成酶、S 腺苷甲硫氨酸脱 羧酶、精氨酸脱羧酶、γ-谷氨酰转肽酶、亚硝酸还原酶及胞质氨肽谷氨酰胺氨基转移 酶等，主要参与蛋氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和谷胱甘肽等 氨基酸的代谢。其他涉及胞内运输、信号转导、蛋白质降解与储存、能量、转录、细 胞结构与细胞生长及未知功能基因分别占 1.16%、6.63%、4.23% 、5.57%、9.70%、7.69% 和 10.56%。 3.在茶愈伤组织中添加茶氨酸合成的前体物、代谢中间产物及信号分子等成分， 应用高效液相色谱分析愈伤组织生长过程中茶氨酸的变化及其在对照与处理之间的差 异。分析了茶苗水培中添加 (NH ) SO 诱导前后的茶氨酸含量变化，同时对遮阴、遮 4 2 4 阴与水杨酸或盐酸乙胺组合处理以及不同品种的茶苗嫩叶中茶氨酸含量差异也进行了 初步地探讨。试验结果显