茶树脱水素基因hn2的原核表达和体外功能鉴定.pdf

摘 要 脱水素最早发现于20世纪80年代，它是植物中的一类胚胎发育后期丰富蛋白 abundant (1ateembryogenesis 200 KD不等。近年来关于脱水素的研究发展很快，特别是逆境下脱水素对植物的保 护作用引起了人们广泛的关注。脱水素富含甘氨酸和赖氨酸，具有很高的亲水性，能 与膜脂结合阻止水分过多流失，以保护细胞免受干旱损伤。另外，脱水素还具有蛋白 保护能力，其K片段的双亲水a一螺旋结构可以稳定蛋白质结构，起到了类似于分子 伴侣的作用。 茶树(Camelliasinensis)是一种多年生亚热带经济作物，易遭受冻害。所以茶树 抗寒性机制和抗性育种一直受到较多的关注。我们在开展茶树抗寒分子机理研究中， 成功构建了低温诱导下茶树的SSH文库，筛选获得一条脱水素基因片段，用RACE 文以国家品种舒茶早(C．sinensis 变化。同时，对茶树脱水素基因dhn2进行原核表达与鉴定，对融合蛋白进行亲和纯 化，鉴定其抗脱水性和抗冻性。这些将为深入研究茶树脱水素的抗逆作用机理提供参 考。 研究取得以下结果： 方式，发现dhn2基因能被低温，脱水和ABA等非生物胁迫所诱导。其中，低温和干 旱胁迫对该基因的诱导作用都较为明显。推测该基因在茶树抗寒和抗旱过程中有着重 要的作用。 KD左 诱导4h，脱水素融合蛋白可获得最佳表达；经SDS—PAGE检测，分子量为53 右，与预测的基本一致。用Ni2+．NTA亲和层析柱纯化，纯度可达90％。采用 Anti．Dehyd血多克隆抗体，融合蛋白经Westernblotting检测确定为脱水素。 (3)脱水素蛋白体外功能研究表明：脱水处理导致苹果酸脱氢酶丧失了67％的酶 活，乳酸脱氢酶经反复冻融后，酶活力损失达到80％。在脱水与冻融处理中脱水素蛋 酶活可保留86％，LDH酶活可保留62％。与常被用作商品酶的稳定剂BSA相比，抗 脱水能力较优，而抗冻能力稍低。 关键词：茶树；脱水素；定量PCR；原核表达；蛋白纯化；体外功能鉴定 Abstract was foundin1980s．whichisakindoflate abundant Dehydrinfirstly embryogenesis tothe of LEAD-IIanditsmolecular from9to proteins．Itbelongsfamily weight changing 200KD．Inrecent researchof advanced their years．the dehydrin rapidly,espcially functiontothe attractedmoreandmore attention．The protecting plants pepole’S dehydrin isabundantin and ofthat are andCan glycinlysine，becausedehydrinshighlyhydrophilic combinewithcellmembraneinorderto watererosion．Thatis easily preventexcessively thereason Can cellsfromthe of whydehyd