抗寒基因的克隆根癌农杆菌介导的ice1基因转化柑橘的研究.pdfVIP

缩略词表 II 华中农业大学博士论文 中文摘要 柑橘是世界上最重要的果树之一，在我国水果产业中占据了重要的经济地位。 然而，周期性的冻害严重影响了柑橘的产量和品质，这个问题的解决有赖于柑橘的 抗寒育种和抗寒栽培。柑橘类植物的多胚性、遗传背景复杂、童期长、单性结实的 特点限制了柑橘常规育种的发展。柑橘组织培养以及建立在此基础上的遗传转化为 缩短育种周期、获得抗寒、优质柑橘种质资源提供了新的途径。 本实验以冷敏感的尤力克柠檬(Citrus 材料，建立了高效的再生体系；以田间茎段为材料，建立了我国大力推广的栽培品 Newhall)的成年态组织培养体系，为成 种一纽荷尔脐橙(Csinensis(L．)Osbeekcv 年态柑橘的遗传转化打下了基础。利用从拟南芥中克隆的lCE』基因构建了植物表 达载体，并通过根癌农杆菌介导的方法将该基因导入了尤力克柠檬中，初步建立了 根癌农杆菌介导的柠檬实生苗转化体系。 主要研究结果如下： CV．Eureka)不定芽再生的主要因素。 1)研究了影响柠檬(Climon(L)Burm，f 结果表明：外植体类型，培养基中生长调节剂浓度配比，暗培养时间对柠檬不定芽 的再生有显著的影响。上胚轴是再生不定芽的最佳外植体类型。上胚轴在基本培养 浓度分别为1．O和O．1Ld时，上胚轴不定芽分化率达到76．6％，此时不定芽数也 mg 达到最高，为9．25个。暗培养20d有利于不定芽数的提高，最高达到每个上胚轴 不定根的伸长，NAA有利于不定根数量的增加。 2)利用纽荷尔脐橙(Csinensis(L．)OsbeckCV．Newhall)田间成年态茎段为材 料，建立了高效的植株再生体系。实验结果表明：纽荷尔脐橙节段以及节间茎段均 可通过器官发生途径再生不定芽。光照条件和植物生长调节剂的组合影响了不定芽 d暗培养有利于不定 的再生，在1．0mgL。BAP和0．5mgLlNAA的培养基中，15 芽的再生，此时节间茎段不定芽的再生率达到了85．2％，平均每个外植体上产生了 L。1NAA的1／2MT生根培养基中 3．7个不定芽。伸长的不定芽在附加0．5或1．0mg 生根并移栽成活。 类GPAT基因的Expression 长约500 bp的片段，生物信息学分析表明该片段和已知的GPAT基因序列以及类 GPAT基因没有明显的相似性，说明扩增的序列非目的片段。在文中对出现这种情 华中农业大学博士论文 况的可能原因作了探讨，并提出了初步解决方案。根据GeneBank中已发表的拟南 35S 基因的编码序列。以双元质粒载体pMV为基础，构建了由组成型启动子CaMV EHAl05，得到工程菌株。 4)对影响柠檬上胚轴转化的条件进行了研究，结果表明幼嫩外植体可提高转 化效率；上胚轴在农杆菌菌液中侵染7．5．30mira时，转化频率没有明显的差异；在 共培养培养基中加入100 rtM或200“M的乙酰丁香酮有利于柠檬上胚轴的转化：黑 暗中短时间的预培养可提高转化的效率，长时间则提高不定芽的爵生率，但降低转 化效率。另外，19C的共培养温度，5d的共培养时间，利用烟草悬浮细胞看护培 养柠檬上胚轴以及在共培养培养基中添加0．2 L4的2，4．D均提高了柠檬上胚轴 mg 的转化效率。在所有处理中，转化效率最高可达到15．4％，大大高于文献报道的柠 的基因组中，并且在柠檬基因组中以多拷贝的形式存在。在转化中共获得7个转基 因柠檬植株，其中5棵移栽成活。 关键词：上胚轴；成年态茎段；抗寒；农杆菌介导的转化：1CEI