茶氨酸合成相关因RNAi载体的构建及茶树遗传转化研究.pdfVIP

摘要 茶氨酸为茶树特有的非蛋白质氨基酸，催化其合成的关键酶尚未研究清楚。 RNAi是双链RNA 的衍生复合物诱导同源基因mRNA 降解的转录后基因沉默技 术。在本实验室构建的茶树幼根cDNA文库中，获得GS1-1基因（contig47 ）的EST 序列，通过实时荧光定量PCR技术验证该基因可能与茶氨酸合成相关。利用GS1-1 基因的3 ’-UTR及其邻近区域构建RNAi载体进行茶树叶片遗传转化，以期进一 步解释茶氨酸生物合成机制。主要结论如下： 1、茶氨酸合成相关基因GS1-1的RNAi载体构建。在本实验室获得茶氨酸合 成相关基因GS1-1的EST序列的基础上，通过SMART RACE技术获得其3’-端全长 序列。选取3 ’-UTR及其邻近区一段长350 bp序列为干涉的目的片段，再从载体 pJawohl8上选取一段大小为500 bp 的内含子序列（茶基因组内无）为填充片段， 运用―零背景克隆‖技术构建出―发夹‖结构，通过验证该结构正确。将其重组到植 物表达载体pCAMBIA2301上，转化到农杆菌EHA105 中，成功构建出RNAi载体 pCAM-RNAi-GS 。 2 、龙井-43 叶片愈伤诱导最佳激素浓度及抗生素浓度筛选的研究。由于茶树 再生困难，选取龙井43 叶片作为遗传转化受体材料。叶片在1/4MS + TDZ 0.1 μmol·L-1+ IBA 0.49 μmol·L-1+ 2,4-D 0.005 mg·L-1的培养基上培养60 d后，愈伤组 织诱导率最高达96% 。将叶片置于含不同浓度卡那霉素的培养基上培养，获得龙 -1 井-43 的卡那霉素抗性标记筛选浓度为100 mg·L 。 3、根癌农杆菌介导转化龙井43 叶片。以龙井43 叶片为受体材料，预培养3 d 后用活化的农杆菌EHA105 （含RNAi载体pCAM-RNAi-GS ）侵染15 min，置于 YMB培养基中共培养4 d ，脱菌后置于筛选培养基上培养，获得8块抗性愈伤组织。 经GUS组织化学染色和PCR检测验证其中3块（愈伤-4 ，愈伤-5，愈伤-6 ）为阳性 结果。利用0.05% 的三氟乙酸做流动相，高效液相色谱法 （HPLC ）测定抗性愈 伤组织内茶氨酸含量，愈伤-4和愈伤-5茶氨酸含量与对照相比下降了85.09%。 关键词：茶氨酸合成相关基因GS1-1，“零背景克隆”技术，RNAi ，遗传转化， 抗性愈伤 I Abstract As a characteristic component in tea plant (Camellia sinensis), theanine is a nonprotein amino acid, whose synthesis mechanisms has not been clarified. RNAi is induced by the degradation of homologous mRNA, which derived by double-stranded RNA complexes. The EST sequence of GS1-1 gene （contig47 ） was obtained from the cDNA library of young roots of Camellia Sinensis constructed by our laboratory. RT-PCR (real-time quantitative PCR) result had confirmed that the GS1-1gene was highly relevant to theanine synthesis. This study mainly constructed a RNAi vector according to 3 ’-UTR and its adjacent sequence