草莓离体再生及癌农杆菌介导CBF1基因遗传转化的研究.pdfVIP

摘 要 草莓(脚砌x口矗口nd￡豫Duch)是世界上最重要的经济浆果之一。多年来草莓 新品种选育的主要途径是杂交育种，但由于草莓本身遗传性状的高度杂合和多倍性， 使得常规育种费时费力、周期长，见效慢，而且目标性状与不良性状连锁，造成育种 效率低，不能适应草莓生产发展的需要。耐寒耐旱、抗虫、抗病等优良品种的缺乏仍 是目前草莓大田生产上一个严重的问题。植物基因工程的发展和应用则为草莓育种开 辟了一条新途径。由于农杆菌介导的遗传转化主要依赖于受体材料的再生能力及农杆 菌的转化效率，因此，首先良好而高效的受体再生体系建立是进行成功的基因转化关 键所在。本试验以草莓品种达斯莱克特、童子I号、枥乙女、意大利l号为试材，研 究了草莓离体再生过程中基因型、基本培养基、激素配比、蔗糖及琼脂浓度、苗龄和 外植体等对草莓离体再生不定芽的影响，获得了草莓高效的离体再生体系。在此基础 上，对影响农杆菌转化效率的主要因素进行筛选，得到一个最佳的转化体系。通过根 癌农杆菌介导将转录激活因子侧基因导入草蓥基因组，获得转化植株。勋n筛选、 PCR检测证明目的基因己经整合到草莓基因组中。叶片抗寒电导率测定和植株抗寒 生长恢复实验均证实了CB尉基因已在草莓转化植株中得到表达。 主要研究结果如下： (一)建立了草莓离体再生体系 1草莓不同基因型再生能力差异很大，再生频率94％一0％。在四个供试草莓品种 中达斯莱克特再生能力最强，童子】号和意大利l号次之，枥乙女再生能力最弱，几 乎不能诱导出芽。 2，4一D对达斯莱克特叶片诱导效果最 2在不定芽诱导中以3．Omg，L6．BA+O．1mg／L m矾。诱导较好，但它们对不定芽的总体诱导效果都不及Z，4一D。商浓度2，4一D、lBA、 NAA不利叶片再生。1Dz对达斯莱克特无明显促进效果，且不及6．BA。 3基本培养基MS+B5大大促进了叶片不定芽的分化。蔗糖、琼脂浓度分别以3％、 D，7％诱导效果最好。 4叶片再生能力远大于叶柄和根。叶片采取近轴面接触培养基效果最佳a以继代 35～42天的试管苗幼嫩、平展叶片作为接种外植体为宜。叶柄最高再生频率只达40％， 根未诱导出不定芽。 (二)建立了草莓遗传转化体系并获得一批转化植株。 mg，L；通过抑菌 1在农杆菌介导的基因转化中，确定了有效的Kan选择压为20 实验，确定了合适的抗菌素及其浓度(即500m叽Ccf)n 术缝佧释、导师同意 匆全文公帮 2对影响农杆菌转化效率的各种因素进行筛选，得到了一条最佳的转化途径：叶 片在分化培养基上预培养时间为2～4天；农杆菌培养至对数生长期，用MS液体培 养基重薪稀释悬浮培养，调整菌液浓度为oD6∞D．3—0．5；侵染叶盘组织约3～5分钟； 上进行培养，2周后再转接到含有选择压20 m∥LKan和500 mg／Lcef的诱导培养基 上进行选择培养。 (三)转基因植株PcR检测及抗寒性状鉴定 1经20 m“LKan选择压初步筛选出28棵转化植株。以未转化植株为阴性对照， 测结果表明：在这些檀株中有10棵植株经PcR扩增出的特异条带和阳性对照一致， 阴性对照未能扩增出任何条带。这表明CBFl基因已整合进这些植株的基因组DNA 中。 2离体叶片抗寒性鉴定。对植株离体叶片进行抗寒电导率测定，结果表明在一定 的低温范围内，转基因植株电导率明显低于未转化植株，说明转基因植株的抗寒能力 较未转化植株有明显提高，且在不同转基因株系之间抗寒性提高程度有着差异。 3植株抗寒性鉴定。对植株进行抗寒生长恢复实验，转基因植株和末转化植株冻 害程度及生长恢复状况表现出较大差异，证实转基因植株抗寒性明显强于未转化植’ 株。 关键词： 草莓 转录因子CBFl基因再生 根癌农杆菌遗传转化 PCR 抗寒性鉴定