饲料及原料中转基因大豆检测技术的研究.pdf

本研究由 国家转基因生物新品种培育科技重大专项 转基因生物饲料检测与监测技术资助 （No.2009ZX08012 ～ 012B） 摘 要 饲料行业是转基因作物产品的第一大用户，为了完善转基因产品标识制度的实 施，急需建立科学有效、简便快速的饲料转基因成分检测方法。本研究旨在从核酸 水平和蛋白水平对转基因大豆、豆粕和不同类型的配合饲料产品进行定性和定量检 测；并通过干热处理、湿热处理和挤压膨化试验，研究了温度、湿度和压力对转基 因大豆中内、外源基因以及外源蛋白含量的影响，为规范转基因饲料加工工艺及其 安全性评价提供科学依据，主要结果如下： 1. 对 SDS 法和 CTAB 法进行改良，并与试剂盒法进行比较，确定改良 SDS 方法 能够高效快速地提取深加工饲料及其产品中转基因大豆的基因组 DNA，质量和纯度 均高于改良 CTAB 法和试剂盒法。 2. 通过普通 PCR 方法扩增转基因大豆的品系特异性基因，表明饲料及原料中的 转基因大豆属于 GTS 40 - 3 - 2 品系；采用 LAMP 方法对转基因饲料及原料中的 CP4 - EPSPS 基因进行快速检测，灵敏度至少为普通 PCR 方法的 100 倍；以转基因 大豆内源基因 Lectin，CaMV 35S 启动子和 CP4 - EPSPS 抗草甘膦基因作为检测对 象，建立了两套（Lectin 1 / 35S / CP4、Lectin 2 / 35S / CP4）转基因饲料产 品的三重 PCR 检测体系，灵敏度分别为 0.25 % 和 0.5 %；选用含有 8 个目的基因 的标准质粒分子 pTLE8 替代阳性标准物质，绘制了内源基因Lectin 和外源基因 CP4 2 –EPSPS 的荧光定量 PCR 标准曲线，R 0.99，具有良好的精密度和重复性，CP4 -EPSPS 基因的定量低限为 1.57 拷贝，该体系能够满足不同类型转基因饲料产品的 定量检测需求。 3. 利用原核表达系统重组表达 CP4 - EPSPS 基因，经 SDS - PAGE 电泳分析， 表明 CP4 - EPSPS 重组蛋白在上清中表达量较高，经过纯化、透析、冻干后，获得 CP4 -EPSPS 蛋白抗原，大小约为 50 kDa，并制备了效价为 1：729000 的 CP4 -EPSPS 多克隆抗体。 4. 建立了转基因饲料产品的 Western Blot 和 ELISA 检测系统，筛选并优化了 各项参数，检出限分别为 0.5 % 和 0.25 %，具有较高的灵敏度和准确性。13 份饲 料产品经 Western Blot 检测，都有杂交信号出现，表明都含有 CP4 - EPSPS 蛋白； 间接 ELISA 结果表明饲料原料中转基因蛋白的含量较高，加工产品中转基因蛋白的 含量较低。 5. 以转基因豆粕的 Lectin 基因和 CP4 - EPSPS 基因的特定区域为模板，分别 设计 4 对嵌套式引物，对经过干热、湿热和挤压膨化处理的豆粕分别进行定性和定 量 PCR 检测。结果表明不同加工方式会在不同程度上造成豆粕内外源基因的降解， 118 bp 大小的 Lectin 基因片段和 155 bp 大小的 CP4 - EPSPS 基因片段在高温高压 高湿条件下较稳定；CP4 - EPSPS 基因降解程度较小；高含水率会在一定程度上缓 解内外源基因的降解。Western Blot 和间接 ELISA 结果表明膨化豆粕中均含有 CP4 - EPSPS 蛋白，其含量随着温度和含水率的升高逐渐降低，变化规律与 DNA 降解规 律一致。 关键词：转基因大豆；LAMP；PCR；Western Blot；ELISA Detection Methods of Genetically Modified Soybean in Feed Products Abstract The largest consumer of genetically modified crops is the feed i