天牛肠道细菌来源植酸酶的基因克隆、表达及其性质研究.pdf

摘要 3．13．8或EC3．1．3．26)是一类能够降解植酸并释放无机磷和肌醇的磷 植酸酶(Phytase，EC 酯酶。近些年，植酸酶作为一种新型的饲料添加剂和无机磷的替代物，在猪、鸡等单胃动物饲养 业的应用价值已得到充分体现，而在水产养殖方面，具有应用价值的中性植酸酶亟需开发。昆虫 肠道作为一个微生物数量众多且复杂多样的特殊环境，目前几乎没有相关植酸酶的报道。本论文 的研究目的旨在从中性的昆虫肠道环境中获得具有新颖性和应用潜力的植酸酶。 本研究从云斑天牛肠道环境来源细菌中挑选具有种属差异的20株细菌，利用简并PCR和 sp．TN06 来源的phyA06、Serratia sp．TNll5来源的 折叠桶状植酸酶(BPP)基因。通过氨基酸序列比对分析，四个基因与已发表的植酸酶序列最高 的植酸酶基因均具有较高的序列新颖性。通过同源建模分析，三个BPP植酸酶均具有双结构域， 与大多数完成酶学性质分析的单结构域BPP植酸酶不同。Serrat／a sp．TN49是典型的肠杆菌科细 菌，本研究首次从肠杆菌科中克隆得到BPP基因，并首次从单一菌株中克隆到多个植酸酶基因。 进一步的系统进化树分析表明phyB49和与植物共生的Pseudomonasspp．来源的双结构域BPP植 (DE3)中表达。重组蛋白经Ni．NTA柱纯化达电泳纯后，进行了酶学性质分析。 来源于Pseudomonas sp．TN06的PhyA06最适Ca2+浓度是2mM，最适pH值为7．0，最适温 h后， h，酶活保持不 还保留70％以上的相对酶活。PhyA06对胰蛋白酶的降解有抗性，胰蛋白酶处理1 变。该酶的性质特点符合水产养殖业对植酸酶的需求，具有潜在的应用价值。 来源于Serrat／a l mM。实验结果表明，同时具有两类植酸酶的Serrat／a 2．0-9．0范围内都可以有效 sp．TN49在pH 的利用植酸，增强了对不同生活环境的适应性。另外，从中性肠道微生物中分离得到中性植酸酶， 也符合微生物对环境适应性和定向进化的趋势。 来源于Janthinobacterium 15最适Ca2+浓度是1 sp．TNl15的PhyAl mM，最适pH值为8．5， 植酸浓度一致时，PhyAll5具有最高的酶活。在植酸浓度极低(0．1 15 有较高酶活性，该现象至今尚未见报道。经结构和功能比较分析发现，不完整的N端结构域虽然 础理论研究及水产应用的良好材料。 本研究首次对天牛肠道这个特殊生态环境中细菌来源的植酸酶进行了初步研究。结果表明该 环境主要以双结构域BPP植酸酶为主。这些BPP植酸酶的序列和酶学性质具有较高的新颖性， 为今后的基础研究和工业应用提供了良好的实验材料。 菌，沙雷氏菌，紫色杆菌 Ⅱ Abstract EC a initiate 3．1．3．8or of that the of Phytase(EC 3．1．3．26)is enzymes group