纹皮蝇HypoderminsA%2cC基因DNA疫苗的构建及其小鼠免疫特性的初步研究.pdf

摘 要 牛皮蝇蛆病是一种危害严重的人畜共患病，每年都给养牛业带来巨大的经济损 失。国内外研究表明纹皮蝇 Hypoderomin A （HA），Hypodermin B （HB）和Hypodermin C （HC）是该病血清学诊断和免疫疫苗的候选抗原。为了避免药物残留和亚单位疫苗 的各种缺陷，本实验以纹皮蝇Ⅰ期幼虫两种免疫相关基因构建了 DNA 疫苗，并在免 疫水平上进行了研究，为牛皮蝇的免疫防治研究奠定了基础。 本研究根据 Genbank 上的 Hypodermins A,C 基因序列设计上下游引物，以本实 验室构建的pETHA、pETHC 为模板PCR 扩增HA 和HC 基因，以上PCR 产物连接到pMD19-T 克隆载体上并进行序列测定。将序列测定正确的目的片段 (HA和 HC)再亚克隆到真核 表达载体 pcDNA3.1(+)中，构建重组表达质粒(pcHA、pcHC)并经过测序确定其正确 性。结果表明，HA 和 HC 基因序列同 GenBank 上公布的序列（登录号：L24914、 AB054066）核苷酸同源性均为 100%，成功构建了 DNA 疫苗 pcHA 和 pcHC。 牛皮蝇幼虫抗原基因原核表达菌 BL21(含 pETHA)、原核表达菌 BL21(含 pETHC) 以最佳诱导时间均为 4h，最佳 IPTG 浓度均为 0.05mmol/L，最佳诱导温度分别为 37℃、30℃进行诱导表达、提取重组蛋白包涵体、经 8mol/L 尿素变性透析复性后， 再以 Sephadex G-75 纯化后得到纯化的重组蛋白 rHA 和 rHC，然后免疫新西兰白兔 制备高免抗血清。 将构建好的 DNA 疫苗 pcHA、pcHC 和空载体 pcDNA3.1(+)体外转染小鼠胎儿成纤 维细胞，然后以兔抗 rHA、rHC 的高免血清作为一抗，FITC 标记的山羊抗兔 IgG 为 二抗做间接免疫荧光试验 IFAT 检测细胞内目的基因编码蛋白的表达情况。结果表明 转染重组质粒的小鼠胎儿成纤维细胞在倒置显微镜下均可见到均质的蓝绿色荧光， 而转染 pcDNA3.l(+)的小鼠胎儿成纤维细胞中无荧光出现，表明表达的蛋白能与兔 抗 rHA 或 rHC 的多抗发生特异性结合。 用 DNA 疫苗 pcHA、pcHC 和 pcHA+pcHC 经双侧胫前肌注射免疫 BALB/c 小鼠，对 小鼠进行了体液免疫水平研究。实验组（pcHA、pcHC、pcHA+pcHC）中小鼠血清 IgG 滴度随免疫次数的增加而提高，呈现一种逐渐上升的趋势，而对照组（PBS 、 pcDNA3.1(+)）中小鼠血清 IgG 滴度基本上不随免疫次数的变化而提高。实验组和对 照组之间差异极显著（P ﹤0.01），而对照组组内差异不显著（P ﹥0.05）。结果表明 DNA 疫苗 pcHA、pcHC 和 pcHA+pcHC 均能诱导体液免疫。 关键词：牛皮蝇蛆病；Hypodermin A；Hypodermin C；DNA 疫苗；免疫特性 Construction of DNA Vaccine with Hypodermins A, C Gene of Hypoderma Lineatum and Preliminary Study on Immunity in Mice Abstract Hypodermosis is a kind of serious zoonosis, which can produce huge economical loss to animal husbandry every year. The correlative studies indicate that Hypoderomin A (HA), Hypodermin B (HB) and Hypodermin C (HC) are the candidate antigens of serodiagnose and vaccine of Hypodermosis. In order to avoid drug residues and a variety of defects in subunit vaccines, the study constructed two DNA vaccines with first instar larvae immune-r