人肝癌多药耐药细胞MAPK激酶表达和活性的分析.pdf

内容摘要 研究背景和目的： resistance，MDR)细胞的存在是肝癌化疗失败的根本 多药耐药(multidrug protein 细胞MAPK激酶系统的表达有可能逆转MDR。本课题拟采用阿霉素和5一氟尿 嘧啶诱导建立多株稳定的MDR肝癌细胞模型，并对肝癌细胞(MDR+／MDR一细 胞)中MAPK表达谱进行研究，旨在深入探讨MAPK家族成员的表达与活性对 肝癌细胞MDR的影响，期望能为MAPK作为逆转治疗肝癌细胞MDR的分子靶 点提供理论依据。 方法： 采用药物浓度梯度递增诱导法诱导亲本细胞建立人肝癌多药耐药细胞系 resistant1)表达。荧光定量PCR检测人肝癌多药耐药 MRPI(multidrugprotein 键激酶蛋白表达及其磷酸化水平。采用MAPK通路磷酸化抗体芯片筛选人肝癌 信号转导通路蛋白。 结果： 其它多种化疗药物均存在耐药性。与亲本细胞相比较，人肝癌多药耐药细胞P—gp 表达量显著增高，而MRPI的表达并无显著变化。细胞周期分析显示， 比率明显增高，而BEL7402／5．FU细胞G0／G1期比率明显增高伴随有S期比率 明显降低。实时荧光定量PCR检测发现人肝癌多药耐药细胞和亲本细胞中均可 检测到ERKl、ERK2、JNKl、 mRNA表达无差异外，其余9种 显著降低的，但在HepG2／ADM中，除P38c5 键激酶的蛋白表达水平变化多样，其蛋白磷酸化水平相对一致；p-ERKI及 和BEL．7402／5．FU中明显降低。MAPK通路磷酸化抗体芯片检测结果显示， 是恒定的差异表达蛋白，共有12个蛋白，占MAPK通路磷酸化抗体芯片总蛋白 数的6．49％，可能为人肝癌多药耐药细胞与亲本细胞间的差异表达蛋白。其中 表达升高的蛋白有1个，表达降低的蛋白有11个，涉及MAPK通路上游激活物、 MAPK上游激酶以及下游底物等多个水平。 结论： (1)采用药物浓度梯度递增诱导法成功建立人肝癌多药耐药细胞系 癌多药耐药细胞系细胞周期分布发生改变，这种改变不仅与耐药肿瘤细胞的增 殖能力降低有关，而且可能是多药耐药产生的机制之一；P．gP参与了人肝癌多 药耐药细胞系药物转运泵介导的耐药机制，而MRPI与之无关。 (2)MAPK关键激酶在人肝癌多药耐药细胞和亲本细胞中均普遍表达： 对于P．gP介导MDR的人肝癌细胞多药耐药细胞，MAPK关键激酶在基因水平、 蛋白水平以及蛋白磷酸化水平的表达变化趋势并不一致；多数情况下，ERKl、 表达与MDR是正相关或负相关，尚需深入研究加以明确。 (3)蛋白芯片能够成功筛选出入肝癌多药耐药细胞和和亲本细胞问差异 表达的MAPK信号转导通路蛋白(12种)，为进一步深入探讨肝癌MDR的发生 机制、寻找逆转治疗靶点提供了线索。国内外文献未见报道。 (4)结合相关文献，我们认为人肝癌多药耐药发生的可能分子机制如下： 化疗药物 !! + MAPK上游激酶 -MAPK上游活性分子一!! MAPK关键激酶 MAPK下游底物 (ERKl／2，JNKI／2／3、ERK5等)(c-Jun、tau和p53等) P-gp过表达、 ‘(+) ÷一 凋亡减少等————_MDR 但这些MAPK关键激酶及差异表达的MAPK信号转导通路蛋白能否作为逆 转肝癌MDR的靶点，还需我们正在进行中的系列研究去证实。 【关键词】肝癌；多药耐药；丝裂原活化蛋白激酶；P．糖蛋白； 多药耐药相关蛋白；蛋白芯片； Abstract Background： almost in resistance(MDR)is Multidrug constantlyexpre