原位杂交DIG..doc

原位核酸分子杂交技术 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测,基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相信在不久的将来,原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。 第一节 原位核酸分子杂交技术的发展 原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，BuongiornoNardelli和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。Orth(1970)应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等特点，因此研究用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交，引起了许多学者的重视和探索。Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer(1982)报道用2，4二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶标抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶组织化学的方法显示杂交 信号。Brigat(1983)首先建立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位，生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。Boeringer Mannhem Biochemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场，和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶显色系统)，有较好的反差背景，更有利于与免疫组织化学相结合，同时可以检测基因表达。核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸 性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核甘酸探针等。DNA探针还有单链DNA(Single stranded,ssDNA)和双链DNA(Double stranded,dsDNA)之分。所以原位杂交可分为DNADNA，cDNARNA,RNARNA和寡核苷酸探针与DNA或RNA等杂交方式。原位杂交技术在生命科学的研究中可视为一顶革命性的技术。它使我们的研究从器官、组织 和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展.。 第二节 原位分子杂交技术的基本方法 原位杂交技术的基本方法包括：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何 增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示(visualization )：包括放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色。 (一)固定 原位杂交固定的目的是为了保持细胞形态结构，最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平； 使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA更易被酶降解，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存