利用重组蛋白检测ETEC菌毛抗体的间接ELISA方法的建立.pdfVIP

维普资讯 第 3O卷 第 7期 中 国 预 防 兽 医 学 报 Vo1．30．NO．7 2008年 7 月 ChineseJournalofPreventiveVeterinaryM edicine Ju1． 2008 利用重组蛋 白检测 ETEC菌毛抗体的 间接 ELISA方法的建立 赵 鹏 ，魏广丽，王桂华，曹 宁，余丽芸 f黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319) 摘 要：通过构建pQE．30Xa+K99重组质粒获得产肠毒素大肠杆菌(ETEC)重组 K99蛋 白的高效表达， Westernblot检测该重组蛋 白具有很好 的免疫原性 。利用纯化 的重组蛋白为抗原，通过方阵试验确定了包被抗原 的最适包被浓度为0．7 孔 ，血清最佳稀释倍数为 1：800，酶标二抗最佳稀释倍数为 1：6000，初步建立 了检测 牛血清中抗 ETEC茵毛抗体的间接 ELISA方法。经特异性试验 、敏感性试验和重复性试验证明，该方法具有 良 好 的特异性和敏感性 ，重复性好。 关键词 ：间接 ELISA；重组蛋 白；产肠毒素性大肠杆菌 中图分类号 ：$852．65 文献标识码 ：A 文章编号 ：1008．0589(2008)07．0533．04 DevelopmentofanindirectELISA fordetectionofETEC pilusantibodiesusingrecombinantproteinasantigen ZHAO Peng，WEIGuang—li，W ANG Gui—hua，CAONing，YU Li—yun (HeilongjiangAugustFirstLandReclamationUniversity，Daqing163319，China) Abstract：AnindirectELISA wasestablished fortherapid detection ofspecificbovineETEC antibodiesin cattle，using purifiedrecombinantK99proteinasanantigen．TherecombinantK99proteinwasexpressedfromrecombinantplasmidpQE-30 Xa+K99in Escherichiacoli，anditsantigenicitywasconfirmedbyWestern blotTheassaywasestablishedusing0．7IxgofK99 proteinascoatantigenperwel1．withtheoptimaldilutionof1：800ofrtestingserum and 1：6000ofrHRP-labeledmiceanti-bovine IgG．Thespecificity，sensitiviyt andreproducibiliytwasevaluated． Keywords：indirectELISA；recombinantprotein；ETEC 产肠毒素性大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichia 目前 ，检测菌毛抗体的方法有血清凝集试验 coli，ETEC)是引起幼 畜及人类腹泻的主要病原之 (SAT)t、免疫荧光抗体试验 (IFAT)t51和酶联免疫吸 一 … ， 粘附素性菌毛的粘附作用是该菌致病的先决 附试验 (ELISA)[61等。凝集试验敏感性和特异性较 条件 】。迄今，在动物ETEC中已发现的菌毛主要有 差 ，经常会出现假阴性的情况 。免疫