质粒DNA限制性内切酶酶切分析.docVIP

质粒DNA的限制性内切酶酶切分析实验目的? 学习和掌握限制性内切酶的特性掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法?并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。??2. 相关基础知识??限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR?I和EcoR?II，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilus?influenzae)的Hind?II和Hind?III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。?? 1) 寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。 2)限制性核酸内切酶的类型及特性? ????按限制酶的亚基组成和切断核酸情况?的不同，分为三类：? ????????????Ⅰ型? ????????????型*? ?????????????型? 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。? 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。?? 第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式： 粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。平头末端：?II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV?的识别位置是：??3）?同裂酶和同尾酶：?同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。? 同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如Hpa和Msp的识别顺序都是? 5’……G|CG?G……3’? 3’……G?GC|G……5’? 如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有Hpa能够切割。??同尾酶：有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。 4)?限制性核酸内切酶的命名法? 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.?coli?用Eco表示，所以用斜体字。? 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus?influenzae)Rd菌株用d，即Hind。? 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如Hind,??HindⅡ，Hind等。3. 酶切反应的设计一般应注意问题: 1)大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的10%。 2)反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的基因组DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。同时RNA应该尽量消化去除。 3)当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，必须选择好通用缓冲液，则两种酶才可同时切割。4)酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有