乌鳢胰蛋白酶的分离纯化、性质分析和分子克隆.pdfVIP

酶在食物消化过程中发挥不同的作用。通过对特异性的底物进行动力学参数研究，以 为148和116S～，催化效率‰。必，m分别为144．7和174．9SI／／％M，由此得出胰蛋白酶B 对底物的催化效率高于胰蛋白酶A。 结合肽指纹图谱结果并以胰蛋白酶保守位点为依据设计引物，采用5-RACE、 3-RACE和RT-PCR方法，克隆得到一条916 bp的cDNA，编码247个氨基酸，该基因 该cDNA序列包括一个9 bp的5’一非编码区，744bp的开放阅读框和163bp的3’．非编码 区。氨基酸序列中包含一段15个氨基酸残基的信号肽和9个氨基酸残基的酶原激活肽 (TAP)，成熟的胰蛋白酶氨基酸序列包含223个氨基酸残基，成熟胰蛋白酶的理论分子 量约为24．45 蛋白酶含有在脊椎动物胰蛋白酶氨基酸序列中保守的12个Cys残基，可以形成六个二 硫键。通过分析胰蛋白酶原的氨基酸组成发现，含量最高的为丝氨酸(35个)，占氨基 酸总量的14．2％，其次为甘氨酸(23个)，占氨基酸总量的9．3％。通过对胰蛋白酶原的 酶切位点进行分析可知，乌鳢胰蛋白酶原含有16个胰蛋白酶的酶切位点和22个胰凝乳 蛋白酶的酶切位点，且酶切几率大于80％的分别有14个和17个，这说明胰蛋白酶在纯 化过程中容易发生自身降解或被其他酶降解而导致分子量变小。胰蛋白酶的二级结构主 要包括旺螺旋、p折叠和无规则卷曲，用同源建模法分析乌鳢胰蛋白酶的三级结构，胰 蛋白酶含有两个结构域，二者结构相似，都含有一个p折叠构成的中心和一个cc螺旋， 由无规则卷曲包裹，活性中心在两个结构域中间。 关键词乌鳢，胰蛋白酶，纯化，性质分析，分子克隆 II andcDNA of Purification，characterizationcloning fromthe of trypsin pancreas arg Abstract an ofserine Trypsin(EC3．4．21．4)isimportantendopeptidase atthe sideof and residues．It specificallyhydrolyzespeptidescarboxylargininelysine plays of andbiochemicalfunctioninfish．At roles trypsins significantphysiological present，many fromdifferentfisheshavebeen athomeand of abroad．However,thetrypsins reported reports thanthosefrommarine fromfreshwaterfishesaremuchless an economicfishin fromsnakeheadhasnot China．However,the important trypsin argus)is beenresearched．Inordertoresearchthetheoriesof