ttmv or1基因的克隆表达及间接elisa检测方法的建立.pdf

摘 要 目的：确定上海地区TTMV 的流行毒株，并设计特异性引物进行原核表达、纯 化，最终建立间接 ELISA 检测方法，为临床 TTMV 的诊断提供理论基础。 方法：采用巢式 PCR 技术分别检测 TTMV 4 个型的阳性率，利用 Mega4.0 软 件和 DNASTAR 进行进化分析和同源比对，并绘制系统进化树；将 TTMV 2 型 ORF1 基因在大肠杆菌中进行原核表达，用 Ni-NTA 柱对表达产物进行纯化，采用 Western blot 检测并分析结果，并以此重组蛋白包被 ELISA 板，通过反应条件的优化，建立 检测 TTMV 血清抗体的间接 ELISA 方法，并利用该方法检测临床 280 份血清样品。 结果： （1）被检的 176 份血液样品中，TTMV 2 型感染率最高，达到 14.2%,进行同源 比对并绘制系统进化树，确定 TTMV 2 型 AB038628 和 AB038626 毒株为上海地区 的流行毒株。 （2）TTMV 2 型 ORF1 基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达， 表明该重组蛋白具有良好的反应原性，能够很好的识别 TTMV 抗体。 （3）建立的TTMV 间接ELISA 检测方法，经重复性试验、特异性试验和灵敏 性试验结果显示，该方法具有较好的可重复性；与 TTV、HIV 、人星状病毒和人博 卡病毒阳性抗体均无交叉反应。 结论：TTMV 2 型 AB038628 和 AB038626 毒株为上海的流行毒株,且 2 型 ORF1 基因的原核表达产物具有良好的反应原性，并将该重组蛋白作为抗原包被 ELISA 板，建立了检测 TTMV 的间接 ELISA 方法，对上海地区和辽宁地区 280 份血清样 品进行了检测，阳性率分别为 34.68%和 39.74%，可作为诊断TTMV 的实验依据。 关键词：Torque teno mini virus （TTMV ）; ORF1；原核表达；间接ELISA The Prokaryotic Expression 、Purification of TTMV of ORF1 and Development of an Indirect ELISA Diagnostic Method Abstract Objective: Determined the epidemic strain of TTMV in Shanghai, and designed specificial primers on the prokaryotic expression and purification, eventually established an indirect ELISA detection method, so that provided the theoretical basis for clinical diagnosis of TTMV. Mehod: Adopted nested PCR technology four TTMV genetypes were detected respectively, used the Mega4.0 software and DNASTAR to have the evolutionary analysis and homology, then rendered system evolutionary tree; TTMV ORF1 gene type 2 expressed in e.coli,Used Ni -NTA column to have the express product purification,and Western blot adopted to test and analysis results. With recombinant protein of TTMV as the coating antigen, optimized the reaction conditions and established an indirect ELISA method to de