实时荧光定量pr技术快速定量检测h3n2、h1n1和h1n2亚型猪流感病毒.pdfVIP

摘要 2005(H1N1)和A／Swine／Tianj H3、N2、H1和N1)和五条TaqManMGB探针，RT—PCR扩增猪流感病毒 Q， 分析结果显示重组质粒中连入的M、H3、N2、H1、N1基因与本实验室保存的猪流感病毒 源性在97．5％以上，从而从分子水平上确定重组质粒中连入基因的正确性。在M基因单 项Real-time PCR检测实验中，通过对引物和探针浓度、Mgcl：浓度、dNTP浓度、循环 次数、退火温度的一系列优化比较，建立了最佳的反应体系和扩增程序，标准曲线上各 点均匀一致等反应条件后，建立了Real—timePCR诊断方法，同时应用于H3、N2、H1、 N1基因的检测。 为使建立的方法在检测病毒同时又能量化样品中病毒含量，使用含有选定检测序列 的重组质粒标准品制作标准曲线，结果表明该方法的灵敏度为100拷贝／反应，对猪瘟 病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠 炎病毒进行检测，结果无交叉反应，特异性好、重复性佳。最后，用建立的荧光定量PCR 方法对19份人工攻毒样品和30份现地样品进行检测并同时进行病毒分离，结果表明， 荧光定量PCR方法和病毒分离的符合率为100％。证明建立的荧光定量PCR方法具有特异、 敏感、快速、高通量等优点，在检测猪流感病毒和作为一种先进的猪流感病毒基因组复 制定量研究方法上具有应用价值。 MGB探针；实时荧光定量PCR 关键词：猪流感病毒；TaqMan Abstract M tothesubmittednucleotide of of According sequencesgene，H3N2，H1N1gene inGenBankofdifferentstrainsof the reported H3N2，H1N1， 2007(H1N2)andsequences H1N2 SwineInfluenza of and five Virus，five subtype pairsprimer(M，H3，N2，H1N1)and to the MGB were of used M，H3，and TaqManprobe synthesized，thesepairsprimer amplify N2 H1，N1genes genesofA／Swine／Guangdon管9|2005(H3N2)and RT-PCR RNAas ofthe usinggenome template，theligationproduct 2005(H1N1)by thentransformedintoE．coli withthelinearvector was amplifiedfragment pMDl8-T cells．Afteridentified recombinant competent