家养野猪源猪圆病毒2型安徽株的分离鉴定及其特性研究.pdfVIP

中 文 摘 要 猪圆环病毒 2 型 （Porcine circovirus type 2 ，PCV2 ）引起的临床症状主要为猪断 奶后多系统衰竭综合征 （PMWS ）、猪皮炎- 肾病综合征 （PDNS ）、猪增生性坏死性 肺炎 （PNP ）、猪先天性脑震颤 （CT ）、猪的流产与繁殖障碍等。PCV2 及其相关的 猪病已在全世界范围内发生和流行，造成的危害相当严重。目前国内许多地方都在进 行野猪资源的开发利用。为了了解安徽地区家养野猪是否存在 PCV2 感染，以及其在 分子遗传特性和生物学特性是否存在差异。本研究对家养野猪病料进行 PCV2 分离与 鉴定，全基因组测序以及各阅读框序列分析，与小鼠致病性实验。从而为了解家养野 猪源 PCV2 安徽分离株的分子遗传特性和生物学特性，为猪圆环病毒病的研究提供依 据。 1. 应用 PK15 细胞进行 PCV2 的分离与增殖，根据 PCR 、IFA、电镜技术进行 PCV2 分离株的鉴定。获得一株来自安徽家养野猪源 PCV2 分离株，命名为 YZ0901 。首次 证明了安徽省家养野猪中也存在 PCV2 的感染。 2. 对YZ0901 株与5 株PCV2 安徽分离株进行全基因组克隆和序列分析。YZ0901 株基因全长 1767bp 组成，属于 PCV2-1C 基因簇，存在同源重组，与 42 株国内外参 考毒株全基因组序列之间同源性为94.2-99.5%，ORF1 和 ORF2 核苷酸序列同源性为 96.7-100%和 89.6-89.3% 。YZ0901 株 ORF1 相对保守，但 ORF2 差异较大，主要散在 于 ORF2 两个主要免疫反应区内。YZ0901 株基因型与安徽地区 PCV2 流行毒株相关。 3. 根据 ORF2 的序列设计两对特异性引物及TaqMan 探针，以重组质粒为标准品 做标准曲线，建立了 PCV2 的TaqMan 荧光定量 PCR 检测方法。TaqMan 荧光定量建 1 立的标准曲线循环阈值(Ct 值)重复性较好，灵敏度约为 6 ×10 拷贝/ μL，对猪呼吸与 繁殖障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟兔化弱毒无交叉反应。在临床样本检测中， 该方法检测快速，灵敏度高。表明本方法快速、敏感、特异性强，具有较高的重复性， 为 PCV2 的临床检测及组织亲嗜性、细胞培养特性等研究提供技术支持。 4. YZ0901 株与 3 株家猪源毒株进行小鼠攻毒实验，对其抗体、细胞因子和各组 织中病毒粒子数量进行检测，并观察病理变化。YZ0901 株的IFN- α、IFN- γ、IL-2 、 IL-10 的浓度处于较低的水平，抗体波动大，引起脾小体增多和肾小球肿大、细胞增 4 4 多的程度较大，且病毒粒子数的最高值(5.35 ×10 拷贝/ μL、5.995 ×10 拷贝/ μL)比 其它各组大。表明 YZ0901 株感染小鼠，先产生细胞免疫抑制，后产生体液免疫抑制， 并对脾脏、肾脏的亲嗜性较强。同属于PCV2b-1C 基因簇的YZ0901 株与 XC0801 株 的免疫应答能力比PCV2b-1A(DY0801 株) 、PCV2b-1B(BH0801 株) 的低，对组织的亲 嗜性则强于 PCV2b-1A 基因簇而弱于 PCV2b-1B 基因簇。 关键词：猪圆环病毒 2 型，家养野猪，分离鉴定，序列分析，致病性 I Abstract PCV2 is the virus associated with postweaning multisystemic wast