小鼠恒定链短肽i-key增强免疫应答的研究.pdfVIP

摘要 主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)，是由一群紧密 连锁的基因群，定位于动物或人某对染色体的特定区域，呈高度多态性；其编码的 分子表达于不同细胞表面，参与抗原递呈，制约细胞间相互识别及诱导免疫应答。 MHC基因家族分为两个主要的亚族：即I类基因和II类基因。MHCII类分子的q、 p链在内质网中与它的Y链聚合，形成九聚体。不同于0【和p链的多态性，1，链为非 多态性，被称为恒定链(Invariant 分子，它在MHCll分子的正确折叠、组装、结构维持及表达蛋白和抗原呈递中起 重要的作用。在后续研究中发现Ii链跨膜区与CLIP区N端相连的四个氨基酸序列 (LI洲K)，与抗原表位连接后形成的嵌合体可以起到增强免疫应答的效果，同时 LRMK也被称作Ii．kev。本文研究了小鼠Ii链不同片段作为免疫载体在免疫应答中 的作用。 001042605)， 首先，通过登录GenBank数据库获得小鼠Ii链序列(登录号：NM 对序列分析后依据划分的胞浆区、跨膜区、CLIP区、三聚化区分段设计多对引物， 同时用实验室保存的F306(新城疫病毒的NDVF蛋白的嵌合串联表位)，克隆重组 含有F306的不同Ii片段的基因嵌合体，将不同片段分别插入到原核表达载体 pGEX一4T-1、pET-32a。经PCR鉴定和测序结果表明各个重组质粒均成功构建。 其次，诱导表达10个融合蛋白，在表达条件优化处理后进行大量表达。大量 表达的细菌经反复冻融和超声裂解处理后，提取融合蛋白，用改良的KCL染色切 胶法纯化目的蛋白。经sDS．PAGE电泳检测，10个重组质粒均在大肠杆菌中正确 KD、37．OKD、37．2KD、44．8KD、45．0KD、 表达，分子量分别为29．8KD、36．6 57．5KD、23．8KD、24．8 KD、23．0KD，与理论预测结果一致。 最后，用含有不同Ii片段载体F306抗原肽，免疫6～8周龄的雌性Balb／c小鼠， 第三次免疫后经H艮球采血，分离血清检测抗体。间接ELISA法优化条件后检测不同 别是单独F306抗原肽的2倍和4倍，而增加胞浆区和跨膜区后抗体效价达到了单 倍。试验中所用的F306是NDV 嵌合体，分别单独检测这6组抗体，结果显示F72的抗体效价明显高于F16l、F343， 说明NDV F蛋白的优势抗原表位在66．92位氨基酸。 综上所述，本文成功克隆了小鼠Ii链基于Ii—key的不同功能区基因片段，并与 表位基因F306组成了嵌合体；各片段分别插入到原核质粒pGEX．4T-1、pET-32a ㈣嬲 中，经表达后成功获得了目的基因的融合蛋白；多种蛋白经提纯后免疫Balb／c小鼠， 测定抗体效价，分析了小鼠Ii链多种片段作为载体在免疫应答中的作用。为新型的 恒定链活性片段载体疫苗的临床应用奠定了基础。 关键词：小鼠，恒定链，免疫载体，抗体检测 Abstract of abunchof M旬orhistocompatibilitycomplex(MHC)is composed locatesinthe sitesin andanimal’schromosomes． genesgroups，which specmc people MHCis and distributedonthesurfaceofdifrerentcellssuchas hi曲polymo叩hism antigen