小鼠肝窦内皮细蛋白质表达谱的构建.pdf

摘要 摘 要 蛋白质组学运用“一网打尽”的“组学”研究模式，与以往研究单个蛋白质的“钓鱼”模式有 所不同，它采用大规模、高通量、高灵敏度的技术手段，通过全局性研究基因组所表达的所 有蛋白质在不同时间与空间的表达谱和功能谱，全景式地揭示生命活动的本质。2001年，国 Proteome 际人类蛋白质组组织(Human Proteome 划(Human Project，HPP)。人类蛋白质组计划的首批行动计划包括由美国科学家牵 头的人类血浆蛋白质组计划和由中国科学家牵头的人类肝脏蛋白质组计划。而北京蛋白质组 研究中心作为国际人类肝脏蛋白质组计划的中心实验室担负着解析肝脏蛋白质表达谱的重 sinusoidalendothelial 任。本文所构建的小鼠肝窦内皮细胞(1iver cells，LSEC)蛋白质表达谱 隶属于人类肝脏蛋白质组计划的一部分。 肝脏是人体内最大的实质性器官，平均由3000亿个肝细胞组成，这些肝细胞中含有2000 种以上的生物酶，作为人体生物化学反应的媒介，参与人体各类生命活动，正是由于这2000 多种酶所起的作用，肝脏被称为“人体的综合化工厂”，对碳水化合物、氨基酸、脂质及维生 素等具有重要的代谢功能：对药物及各种毒素有重要的解毒功能；对消化道来源的抗原具有 重要的免疫功能；此外，还具有分泌胆汁、造血储血、合成凝血因子及再生等功能。生物学 发展到今天已经进入细胞生物学和分子生物学水平，细胞水平的研究具有简便、快捷、作用 单一的优点，肝脏由多种细胞组成，结构和功能非常复杂，体外细胞水平的研究能够加快人 们对肝脏各种细胞功能的认识。 样品的制备在蛋白质表达参考图谱的构建中具有重要地位，直接影响质谱结果，而LSEC 的纯度及活力直接影响结果的可信度。因此，在LSEC的分离和纯度鉴定上下了比较多的功 夫。首先，在肝脏原位灌注消化的基础上，选择特异性很高的免疫磁珠分选的方法来获得 LSEC；其次，对得到的LSEC进行了严格的纯度评价，使用了包括流式细胞术，细胞免疫荧 光，Ac．LDL胞吞实验在内的3种方法来鉴定LSEC的纯度；再次，为了证实分选得到的细 胞就是LSEC，采用扫面电镜和透射电镜来观察LSEC的窗孔结构，窗孔是LSEC区别于其 它细胞的标志性结构，是鉴定LSEC的金标准。最终证实分选出来是LSEC，并且纯度达到 90％。同时，在分选过程中，我们尽量优化操作。保证LSEC具有很高的活力(94％)和得 率(2．6106细胞／小鼠)。在此基础上，我们建立了从同一组织中同时分离肝脏实质细胞 stellate cells，HSC)的标准操作 (hepatocyte。HC)、LSEC、Kupffer细胞和星形细胞(hepatic 方法(standard operationprocedure，SOP)，并保证所得每种细胞都具有很高的纯度和活力，为 从人肝脏分离四种细胞奠定基础。 采用一维SDS．PAGE，胶内酶切的方式获得蛋白酶切肽段。用LTQ．FT高精度串联质谱 mouse v3．62，对鉴定数据的评 仪进行肽段扫描，使用Sequest软件进行检索，数据库使用IPI 价采用了搜索混合数据库的方法，根据倒置序列占全部肽段的比例来计算假阳性率。在95P2 852个蛋白质。 标准下对LSEC鉴定了3 利用获得的蛋白列表构建LSEC蛋白库。对获得的LSECIPI歹U表进行一系列的注释，包括 ID、Gene名称、Swiss·Prot索取号、Swiss 鉴定蛋白的Gene 生物学功能及蛋白绝对表达量(absolute proteinexpression