布鲁氏菌多克隆体和单克隆抗体的制备与鉴定.pdfVIP

摘 要 布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、兼性细胞内寄生菌,它可以感染人和多种动物, 导致 人和动物的布鲁氏菌病。对于反刍动物，通常引起流产及不孕不育。人患布鲁氏菌病 通常是由于接触患病动物所引起，人与人之间不能传播。过去，布鲁氏菌病曾一度在 全世界范围内流行，造成严重的经济损失。现在布鲁氏菌病在欧、美等一些发达国家， 已得到了有效的控制，但在广大发展中国家仍普遍流行。在我国，布鲁氏菌病曾得到 过有效的控制，但九十年代后，布鲁氏菌病有回升的趋势，特别是近几年来，人和动 物布鲁氏菌病的患病数迅速升高，这也使得对于布鲁氏菌的研究和布鲁氏菌病的诊断 显得尤为重要。 用牛种布鲁氏菌A19 疫苗皮下多点注射免疫两只新西兰兔，两周一次。在第二 次免疫两周后用试管凝集试验测定其血清效价为1:1600，达到所需标准，然后兔心 脏采血并分离血清，用硫酸铵沉淀法粗提 IgG ，再用 Sephadex-G25 层析柱脱盐， Bradford 法测定蛋白含量，最后SDS电泳试验鉴定。结果显示成功得到了初 步纯化的兔抗牛布鲁氏菌A19 多克隆IgG 。 采用杂交瘤细胞技术，以布鲁氏菌全菌为抗原，以不同剂量和不同免疫方法免 疫8 周龄BALB/c 小鼠，每次免疫间隔时间为3 周，在融合前3d 进行最后一次加 强免疫。取小鼠脾细胞和SP2/0 细胞经PEG-4000 按10:1 比例进行融合。采用布鲁 氏菌细胞壁抗原作为筛选抗原，用自己建立的间接酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测杂交瘤细胞培养液上清，筛选出的强阳性孔杂交 瘤细胞用有限稀释法克隆培养，直到阳性率达到100%.经过3～4 次亚克隆后，得到 了2 株能稳定分泌抗布鲁氏菌抗体的杂交瘤细胞株，其产生的单抗分别命名为3E7 和 1C6。采用ELISA 方法检测细胞上清和腹水的效价,其中3E7 细胞上清和腹水的 效价分别为1:1600 和1:20480，而1C6 分别为1:800 和1:10240。通过叠加试验对这 两种单抗进行抗原位点分析，结果表明2 株单抗分别针对不同的抗原位点。在单抗 的稳定性试验中，两株细胞在四次克隆化培养的细胞上清的OD450 均有上升趋势， 4 5 四代腹水的抗体效价均在 1:10 ～1:10 之间，说明有较好的稳定性。对硫酸铵纯化 后的3E7 和1C6 单抗进行SDS电泳实验，结果显示，2 株单抗的重链分子质 量为 50kD 左右，轻链分子质量为 25kD 左右。用这两种单抗分别与布鲁氏菌细胞 壁抗原进行 Western-blot 分析，结果显示两株单抗都能够和布鲁氏菌细胞壁抗原结 合，且抗原抗体反应条带分别出现在分子质量为 31kD 和 55kD 的位置，提示这两 种单抗可能是由分子质量为31kD 和55kD 的抗原产生。 关键词：布鲁氏菌；多克隆抗体；单克隆抗体；制备；鉴定 Preparation and Identification of Polyclonal and Monoclonal Antibodies to Brucella Author: Han Li-bin Supervisor: Professor Wang Jia-xin Major: Preventative Veterinary Science Abstract Brucellae are Gram-negative, facultative intracellular bacteria that can infect many species of animals and man.It can cause brucellosis of man and animals.