中国荷斯坦奶牛-防御素基因lap分子克隆及真核表达初步研究.pdf

中文摘要 防御素是广泛分布于动物和植物界的一类富含半胱氨酸的内源性阳离子抗菌 肽，它在先天性免疫系统宿主防御机制中起着重要的作用。研究发现～些B．防御 素基因在奶牛感染乳房炎时可在乳腺中诱导表达，表明在乳房炎发生时D．防御素 可能在乳腺局部防御中发挥作用。本研究进行了B．防御素基因LAP的克隆与序列 分析，构建了LAP基因的真核表达载体，并成功进行了真核融合表达。 实验以患乳房炎的中国荷斯坦奶牛乳腺为材料，提取乳腺上皮细胞总RNA， 19．T 连接至UpMDTMSimple载体中进行序列测定，将测序鉴定正确的克隆质粒命名 为pMDl9．T-LAP。生物信息学分析结果表明，本研究成功扩增出牛p．防御素基因 LAP的编码区序列，大小为195bp，推导该序列编码64个氨基酸，并含有p．防御素 的特征性分子结构即在特定位置上有6个保守的半胱氨酸残基(C)。与已报道的牛 D．防御素基因LAP 98％，有三个碱基发生了变异，分别为核苷酸序列第196的A．G突变、第199和201 位的T-C突变；氨基酸同源性为95％，三个突变碱基引起第63位A玛_÷Lys的变异， 这种核苷酸的序列差异，可能是由于牛的不同品种之间的差异造成的。 pEGFP．C1．LAP构建成功。利用脂质体转染技术，将重组质粒转化到COS7细胞系， 用荧光显微镜检测到增强型绿色荧光，分别提取重组质粒组和空载体对照组转染 细胞内得到转录。 本试验结果为进一步研究奶牛p．防御素基因LAP的表达特性、基因功能及表 达产物的抑菌活性奠定了一定的基础，同时重组多肽治疗和预防奶牛乳房炎提供 了基础资料。 关键词：奶牛；舌抗菌肽(L心)基因；克隆与序列分析；真核表达 ABSTRACT Molecularand of cloningeukaryotic expressionpreliminarystudy antimicrobialof lingual ChineseHolsteinCow peptidegene YuanXi Directed Liuand Cao byChangsongSuizhong of (CollegeVeterinaryMedicine，Sichuan Agricultural China，625014) Defensinsareaclassof cationic antimicrobial eysteine—richendogenous peptideswidely distributedinanimalsand defensinsall roleintheinnateimmune plants．The playimportant system ofhost defensemechanisms．Theresearchfoundanumberof make IB-defensegenes gland inthe whentheCOWSinfectedwith thatthe expressionmammary mastitis，itshows p．defensins aroleinthe localdefenseatthetimeofm