柔嫩艾美耳球虫08与棒状体蛋白的单抗制备及酵母表达系统构建.pdfVIP

柔嫩艾美耳球虫 A08 与棒状体蛋白的单抗制备 及酵母表达系统构建 摘 要 柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella ）是鸡的一种重要的寄生虫，可引起鸡只严重的肠道病变和死 亡，使养鸡业遭受重大损失。柔嫩艾美耳球虫主要的致病阶段在虫体对宿主细胞的入侵，该过程涉 及到多种与入侵相关的因子。本研究以柔嫩艾美耳球虫为研究对象，进行了柔嫩艾美耳球虫 A08 蛋 白（EtA08 ）和棒状体蛋白 （EtRP ）的单克隆抗体（Monoclonal antibody, McAb ）制备，并构建了 EtA08 的毕赤酵母（Pichia pastoris ）表达系统，以期为深入探索这些入侵相关因子的作用机理，开发新的 控制鸡球虫病的方法提供有价值的实验依据。 1. EtA08 和 EtRP 单克隆抗体的制备与鉴定 利用原核表达的 EtA08 和 EtRP 的重组蛋白免疫BALB/c 小鼠，经 4 次免疫后取脾脏制备免疫脾 细胞，与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 融合，经间接 ELISA 和 Western blot 筛选获得 2 株抗 EtA08 蛋白的 特异性杂交瘤细胞株，分别命名为 1G7 和 4F11 ；获得 1 株抗 EtRP 的特异性杂交瘤细胞株，命名为 2E3 。染色体分析表明，3 株杂交瘤细胞的染色体数目都在 94～108 之间。亚类鉴定显示，McAb 1G7 和 2E3 亚类为 IgG2a ，4F11 亚类为 IgM 。效价测定显示，1G7、4F11 、2E3 细胞上清效价分别为 1:1.6 5 6 5 4 ×10 、1:64、1:40，小鼠腹水效价分别为 1:1×10 、1:1.02×10 、1:2.56×10 。同时，试验利用McAb 2E3 对 EtRP 在 E. tenella 子孢子中的分布进行分子定位，结果显示该蛋白主要分布于子孢子的顶端； 而当子孢子在 DMEM 培养基中 41 ℃孵育 1 h 后，该蛋白则分布于整个虫体。入侵抑制试验显示， McAb 2E3 对子孢子入侵体外培养的 DF-1 细胞的抑制率达 63.5%，说明EtRP 在虫体入侵宿主细胞 过程中起重要作用。 2. EtA08 基因毕赤酵母表达系统的构建 根据文献设计一对特异性引物，以 A08 蛋白 cDNA 为模板扩增出 1 083 bp 的目的基因片段，将 该基因连接到 pGEM-T-easy 载体上，序列测定和双酶切鉴定表明 A08 基因克隆成功。用 EcoR I 和 Not I 酶切回收目的片段连接至用同样酶切的真核表达载体 pPIC9k 上，构建了重组质粒 pPIC9k-A08 ， 转化大肠杆菌 TOP10 后，提取质粒，经酶切鉴定正确后用 Sac I 将重组质粒线性化，再电转入毕赤 酵母 GS115 菌株，G418 筛选抗性重组子，经 PCR 鉴定正确重组子后做甲醇诱导表达。重组酵母诱 导表达产物经 SDS检测证实，E. tenella A08 基因在毕赤酵母中成功表达。Western-blot 初步分 析表明，表达产物具有免疫学反应活性。 本试验的上述成果，为进一步研究 E. tenella A08 蛋白和棒状体蛋白EtRP 的生物学功能奠定了 良好的基础，对筛选鸡球虫基因工程疫苗和抗球虫药物靶标分子具有重要参考价值。 关键词：柔嫩艾美耳球虫；单克隆抗体；毕赤酵母；蛋白表达 I Preparation of Monoclonal Antibodies and Expression in Pichia pastoris for A08 and a Rhoptry Protein of Eimeria tenella Abstract Eimeria tenella which cause severe intestines disease and death is an important parasite for chicken, it can inflic