抗隐孢子虫鼠基型cp1560蛋白单克隆抗体的制备及初步应用.pdfVIP

摘 要 隐孢子虫(Cryptosporidiumspp．)是一种严重危害人和动物健康的人兽共患寄生原虫，其暴 发和流行逐年递增，危害不容忽视。尽管尝试了上千种药物，至今尚无有效的治疗药物。因此， 建立灵敏快捷的免疫学检测技术，加强隐孢子虫病的诊断和预防，已经成为当前隐孢子虫病防治 工作的重中之重。随着生物技术的成熟和发展，人们发现特异性McAb在各种疾病的诊断和防治 发挥了极其重要的作用，也可能为隐孢子虫病的诊断和防治提供重要手段。 为获得高特异性的抗隐孢子虫单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)．本研究以原核表 mousc 达的重组隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidium 原，免疫BALB允小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2，o细胞进行融合，用间接ELISA方法进行抗体 效价测定，有限稀释法进行亚克隆。以常规染色体分析法进行杂交瘤细胞的染色体分析；用McAb 亚类鉴定试剂盒鉴定McAb亚型；间接ELISA法测定相对亲和力及交叉反应性：Westernblot检 CPl5／60，rCPl5／60) 测抗体的特异性。结果获得了8株能稳定分泌抗重组CPl5／60(recombinant 2株进行进一步的鉴定，结果染 其腹水抗体效价最高达到1．-l×107。对效价最高的B曷、DsH5 轻链均为K链：相对亲和力常数B4F7株为0．009 tw,／mL、D8H5株为0．016p．g／mL：2株McAb均 与rCPl5／60蛋白发生特异性反应，而与柔嫩艾美耳球虫(Ezmer／atenella)卵囊可溶性蛋白、刚 无交叉反应，表明本试验获得了2株高特异性的抗隐孢子虫McAb。 选取相对亲和力，效价较高的抗隐孢子虫单克隆抗体B4F7株与兔多抗进行双抗体夹,l=i,ELISA 试验，最终建立了用于检测隐孢子虫卵囊的双抗夹心ELISA，绘制标准，对数据进行回归分析， x．0．01，其中x；log(卵囊数量)，该法最低检测限为128个卵囊／mL， 得到回归方程为y=0．27 最适检测范围为128～6．3x107个卵囊／mL．通过交叉反应、重复性检测、双盲试验及敏感性试验 等，结果表明该双抗体夹心ELISA是敏感性高、特异性强的诊断隐孢子虫病的方法。 关键词：隐孢子虫，CPl5／60蛋白。单克隆抗体，双抗体夹心ELISA Abstract a humanandanimal Cryptosporidium(Cryptosporidiumspp．)isparasiticprotozoainfecting be and of is andnot cryptosporidiosis ignored．More seriously,outbreakspread increasingyearly the ofthethousandsof effectivetreatmentsexistednow． importantly,Despiteattempts drugs，no enhance establishmentofsensitiveand the Therefore，the techno