植物缩合单宁对肠杆菌的抑制作用及抑菌机理的研究.pdfVIP

摘 要 近些年，随着食源性致病菌大肠杆菌（Escherichia coli ，E. coli ）O157:H7 在世 界范围内的爆发流行，严重危害着人类健康，已成为世界重要的公共卫生问题之一。 牛是E. coli O157:H7 主要的携带者，不表现任何临床症状，但排出的粪便对周围环 境会有污染，常会造成此病爆发流行。针对 E. coli O157:H7，到目前为止没有有效 的防治措施，减少牛体内E. coli 的排出被认为是最有效的策略。紫色达利菊牧草分 布广、适口性好、单宁含量高，且对E. coli O157:H7 有较好的抑制作用。因此，本 文主要通过草场放牧试验和体外试验来分析紫色达利菊牧草对大肠杆菌的抑制作 用；又通过定性和定量试验来分析非致病性和致病性大肠杆菌对紫色达利菊牧草和 红豆草牧草所含浓缩单宁的敏感性；再选取非致病性大肠杆菌作为模型，从单宁对 大肠杆菌细菌结构，包括细胞外膜、细胞内膜、蛋白质、脂质体以及脂肪酸结构组 成的影响，通过紫色达利菊牧草和红豆草牧草分析缩合单宁抑制大肠杆菌生长的机 理，从而为提出一种合理降低大肠杆菌排出策略奠定理论基础。具体结论如下： 1. 紫色达利菊牧草对牛粪便中大肠杆菌菌群的数量有明显降低的作用，且秋季 放牧更明显。体外模拟瘤胃和大肠试验，结果也表明紫色达利菊缩合单宁对牛瘤胃 和大肠内 E. coli 均有抑制作用，且对瘤胃内的作用较强。 2. 通过药物敏感性的定性试验分析表明：2 株非致病性菌株 ATCC25922 和 ATCC35352 和 5 株致病性 O157:H7 菌株 3081、 H4420N 、 E318N 、 EDL933 和 R508N2006 对同一来源单宁的敏感性相同； 紫色达利菊单宁在浓度 0.01 ～ 0.05mg/mL，红豆草单宁在浓度 0.05～2mg/mL 对 E. coli 都有抑制作用；且同一浓度 下，紫色达利菊所含缩合单宁有着较强的抑菌作用。定量试验即最小抑菌浓度（MIC ） 结果表明：紫色达利菊单宁的 MIC 为 20µg/mL ，而红豆草单宁的MIC 为 100µg/mL ； 且两种单宁对致病性和非致病性大肠杆菌的敏感程度相同。 3 ．在单宁抑制细菌生长的机理研究时选择了 1 株非致病性菌株 ATCC25922 作 为模型，通过紫色达利菊单宁和红豆草单宁对 E. coli 外膜、内膜、蛋白质、脂质体 和脂肪酸变化等方面进行分析。提出了单宁对大肠杆菌的抑制机理。 单宁使细胞结构发生了变化。单宁使大肠杆菌细胞发生聚集，且随着单宁浓度 的增加，聚集作用增强；单宁增加了大肠杆菌的细胞外膜通透性，使细菌细胞外膜 的完整性受到破坏；单宁增加了大肠杆菌内膜的通透性，而且受温度和 pH 变化的 影响。 单宁也使细胞结构的组成成分发生了变化。缩合单宁对蛋白质具有很强的沉淀 能力(P0.001)，尤其对 Rubisco 蛋白质沉淀反应更为明显。以蛋黄卵磷脂作为模型， 结果显示单宁对脂质体都有不同程度的凝聚作用，而且随着单宁浓度的增大，凝聚 作用增强；通过 LIVE/DEAD® BacLight 细菌活力试剂盒和荧光显微镜也观察到了 这个现象。单宁可使脂肪酸构成发生变化，低浓度紫色达利菊单宁，使得成对脂肪 酸 C16 ：0/C16 ：1、TT16 ：0/TT16 ：1、C18：0/C18 ：1、SFA/USFA 显著升高（P ＜0.01 ），而低浓度红豆草单宁无影响；高浓度时紫色达利菊单宁对脂肪酸变化没有 影响，而红豆草单宁增加了主要脂肪酸含量。 单宁会发生自氧化作用，产生H O ，进而使细菌细胞受到影响。 2 2 综合考虑，推测单宁抑制细菌生长的机理是单宁通过结合细菌细胞壁蛋白质， 聚集细胞脂质，以及单宁自氧化产生过氧化氢，而干扰细菌细胞膜的通透性，进一 步改变细菌细胞壁脂肪酸的组成，从而减缓了细菌的生长。 本研究在国内外首次系统的从细菌的细胞膜、细胞壁成分（蛋白质、脂肪 酸变 化等）等方面研究了植物单宁对反刍动物消化道内大肠杆菌的抑制机理。 本研究将为植物单宁在畜牧业生产中更广泛替代抗生素的使用奠定理论基础。 关键词：单宁；大肠杆菌；抑菌；机理 Research on Inhibition Action of Plant Condense