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Chapter 7色谱技术Chromatography 本章主要知识点 什么是色谱分离技术？ 色谱分离技术的分类 什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算？ 吸附色谱及其分类和基本原理 什么是分配色谱？ 离子交换色谱的分类及应用 凝胶色谱的分离原理及分类 离子交换及疏水作用层析的原理 高效液相色谱的分离原理及应用 蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？ 色谱技术（分配色谱） 概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相(气体或液体)，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。 色谱分离方法的分类 色谱分离方法很多，种类有四、五十种 但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分， 有以下几种： 吸附色谱利用物理吸附性能的差异，吸附力不同 分配色谱 利用两液相间分配系数的不同 离子交换色谱 利用离子交换原理，化学亲和力不同 凝胶色谱 利用分子大小或形状差异（排阻作用力的不同） 色谱法简单分类 色谱分离的基本概念 分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd分配系数 q、c溶质在固相和液相中的浓度 阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小，As:固定相平均截面积，Am:流动相平均截面积 洗脱体积Ve 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异,Vm:色谱柱中流动相体积，Vs色谱柱中固相体积 色谱柱的理论塔板数、塔板高度 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： N理论塔板数 tR保留时间 W1/2半峰宽 Wb峰底宽度 理论塔板高度：L柱长 吸附色谱 原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离， 吸附→ 解吸→再吸附 →再解吸 →反复多次洗脱→被测组分分配系数不同→ 差速迁移 → 分离 关键要素：吸附剂和展开剂的选择 吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2 分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 常用的吸附剂： 氧化铝：有碱性氧化铝、中性氧化铝和酸性氧化铝。 ①碱性氧化铝，混有碳酸钠等成分而带有碱性，适用分离一些碱性成分，如生物碱类，但是不宜用于醛、酮、酯、内酯等类型的化合物分离，因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。 ②中性氧化铝是由碱性氧化铝除去碱性杂质，冲洗至中性。仍属于碱性吸附剂的范畴，不适用于酸性成分的分离。 ③酸性氧化铝是氧化铝用稀硝酸或稀盐酸处理得到的产物，并使氧化铝颗粒表面带有 NO3-或 Cl-的阴离子，从而具有离子交换剂的性质，酸性氧化铝适合于酸性成分的柱色谱。 硅胶：适用于中性或酸性成分的柱色谱。硅胶是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，通过离子交换反应吸附化合物。硅胶作为吸附剂有较大的吸附容量，能用于极性和非极性化合物的分离 活性炭：柱色谱用的活性炭，最好选用颗粒活性炭。 活性炭是非极性吸附剂，其吸附作用与硅胶和氧化铝相反，对非极性物质具有较强的亲和能力，在水溶液中吸附力最强，在有机溶剂中较弱，因此水的洗脱能力最弱而有机溶剂较强。主要分离水溶性成分，氨基酸、糖、苷等。 聚酰胺：为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。 聚酰胺对有机物质的吸附属于氢键吸附，通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离氨基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附的强弱则取决与各种化合物与之形成氢键缔合的能力。主要用于分离黄酮类、蒽醌类、酚类、有机酸类、鞣质类等成分。 展开剂的选择 展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果 展开剂选择的原则： （1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小 （2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力 常用展开剂的洗脱能力及极性比较 见书上151~152 一般吸附色谱的操作程序 根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相 吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速）