水稻t-dna入突变体库的筛选及与水稻颖花颖壳发育相关基因的克隆与功能分析.pdf

． 李爱宏：水稻T-DNA突变体库的筛选及与颖壳发育相关基因的克隆与功能分析 摘要 ％DNA标签是一种高通量的分离和克隆植物功能基因的方法，目前在拟南芥 等双子叶植物中己得到广泛应用，但在水稻等单子叶植物中尚处于探索阶段。本 型、不同性状的突变频率、表型突变体的筛选程序、GDNA侧翼序列的分离方法 及整合特性等进行了研究和探讨；对获得的一个颖花颖壳缺失的突变体，进行了 对应基因的克隆、功能验证、表达模式分析：对一个多重颖壳突变体开展了形态 学观察和初步遗传分析。获得的主要研究结论有： 1、对以中花11(ZHll)、中花1 标签系进行了表型鉴定，发现存在拟纯合突变和系内分离突变两种类型：突变表 型涉及株高、生育期、叶形、叶色、分蘖力、植株松紧度、穗颈节、穗形、颖花、 粒形、类病变、雄性不育、生长极性等14类性状。其中，株高、生育期、叶色、 雄性不育等性状有着相对较高的突变频率(1％)，株高和叶色的突变频率在品种 及年度间表现稳定，而生育期、雄性不育波动较大，表明这类性状的表型易受环 境影响。通过T-、T2连续世代的共分离分析，初步筛选出3个与穗部或颖花发育 相关的T-DNA插入突变体，其频率约为1．37‰。为分离相关功能基因奠定基础。 基因内部的特性。 前者对某个特定标签系，筛选含有T-DNA侧翼序列的阳性克隆获得率及测序效率 较高，分离片段较长，但对DNA质量要求较高，操作过程繁琐，工作量较大； 而后者对大规模分离侧翼序列、建立侧翼序列库而言扩增效率较高，且操作简单、 方便、快捷，但就某个特定标签系特异PCR产物的获得率相对较低，且分离的序 列片段一般长度较短。两种方法结合使用，对某个特定标签系其侧翼序列的分离 就会有很大的几率。 hulll， dhl)，开展了基因克隆和功能分析研究。解剖镜观察结果表明dhl突变体表现为 扬州大学博士论文 的内、外稃表型正常，但雌雄蕊发育畸形。扫描电镜和石蜡切片的结果显示dhl 突变体能进行正常的幼穗苞原基、一次枝梗和二次枝梗的分化和发育，进入颖花 器官分化后，部分颖花虽然能分化出护颖，却在内、外稃的分化上表现为功能的 缺失：部分颖花内、外稃发育提前终止或滞后于雌雄蕊的发育，部分颖花表现出 不均衡分裂而产生数目异常的雄蕊，部分颖花雌蕊异常发育而呈现多柱头或2朵 小花的雌雄蕊器官分化后融合在一起的异常现象。上述结果表明DHl基因对颖花 内外稃的形态建成具有重要作用，同时与雌雄蕊的分化、发育也相关。 Southern 显示T-DNA插入到了距一个预测功能基因的、转录起始点上游283bp的位点。通 过T-DNA序列的特异引物与T-DNA插入位点两侧的基因组引物的不同配对进行 PCR扩增，验证了侧翼序列与突变表型共分离。在幼穗分化期取样进行RT-PCR 分析，结果显示dhl突变体目标候选基因(DHl)的转录水平较野生型明显降低。 因而，初步确认T-DNA片段插入到目标基因DHI的启动子附近或重要调节序列 之中，而产生了功能丧失突变。结构域分析结果显示，DHl编码的氨基酸序列含 有保守的LOB(Lateral coil) domain 二级结构，为典型的LBD(LOBgenes)基因家族成员。 生型DHl基因能恢复dhl突变体的表型，从而对DHl基因的功能进行了可靠验 证。DHl基因的原位过量表达，可导致产生植株矮小、穗轴和枝梗变短、叶片下 垂等表型，与拟南芥中部分LBD基因过量表达的表型具有相似性。通过构建 pDHI：：GFP的融合表达载体，研究目标基因的表达模式，结果发现DHl不仅具 有仅在腋芽和幼穗中表达，而不在根、叶、节或节间等器官中表达的空间特性， 同时还有在幼嫩器官中较强表达、而在发育成熟器官中减弱表达的时间特性。 dhl突变体在长光照条件下抽穗比在短光照条件下抽穗有更严重的颖花颖壳 缺失。对DHl基因的启动子区域进行信号调控元件分析，发现该区域存在大量的 光调控元件，从而暗示有两种可能：一是DHl基因在长光照条件下表达量